HPLC法测定蒙药蒙松萝配方颗粒中松萝酸的含量

HPLC法测定蒙药蒙松萝配方颗粒中松萝酸的含量

高嘉琦1，周国立1，宋阿帅1，曹月1，徐佳枫2 ,冯立宝2 张德瑞1*

1.赤峰市产品质量检验检测中心，内蒙古 赤峰 024000

2.祈蒙股份有限公司，内蒙古 赤峰 024000

3.受内蒙古自治区科技重大专项资助（2021ZD0017）

摘 要 目的:建立HPLC法测定蒙药蒙松萝配方颗粒中松萝酸的含量测定方法；方法:色谱柱采用安捷伦ZORBOX C18色谱柱 (250mm×4.6mm，5μm)，流动相:乙腈－5%冰醋酸溶液 (78:22)；流速:1.0mL/min；检测波长: 254nm；柱温: 30℃；结果：松萝酸在0.2001～3.202μg范围内与峰面积线性关系良好，回归方程为Y=2145907.4X+40146.4（R2=1.0000），平均加样回收率为101.1％，RSD为0.7％（n=9）。结论：该方法科学、简便、专属性较强，可有效控制蒙松萝配方颗粒中松萝酸的质量。

关键词：蒙松萝；松萝酸；高效液相色谱法；含量测定

［Abstract］Objective: To develop the methods for the determination of usnic acid in Mongolian Pineapple dispensing granules. Method：Column was Agilent ZORBAX C18 column（250mm×4.6mm，5μm），and the mobile phase was acetonitrile-5% glacial acetic acid solution (78:22)，with flow rate 1mL/min，detection wavelength 254nm，the column temperature was 30℃。Results：The linear relationship between curcumin and peak area was good in the range of 0.2001～3.202μg. The regression equation was Y=2145907.4X+40146.4（R2 =1.0000），the average recovery was 101.1%，and the RSD was 0.7%（n=9）.Conclusion：The method is scientific，simple and specific，and can effectively control the quality of usnic acid in Mongolian Pineapple dispensing granules.

［Keywords］Mongolian Pineapple; usnic acid;HPLC; Determination

蒙药蒙松萝为松萝科植物长松萝Usnea longissima Ach.或节松萝Usnea diffracta Vain的干燥全草蒙松萝的炮制净化品，，蒙药名为 “色日古德”，性味苦、凉、钝、软、柔，具有清热、解毒的功效，用于毒症、腹鸣、泄泻、肠热、筋腱疼痛、肺脓疡等症的治疗 [1]。研究显示，其中重要成分松萝酸（usnic acid）具有抗菌、抗癌、抗病毒、抗滴虫、麻醉镇痛等药理作用[2-4]。蒙药配方颗粒是一种新型药物制剂，它是将药材饮片直接粉碎过筛后与一定的辅料混合制备而成的颗粒剂。该种剂型不经过提取纯化，能够最大限度的保持药材的原本药性，而且方便携带、储存、运输和服用。本文采用 HPLC法，根据《中国药典》四部9101分析方法验证指导原则[5]，以松萝酸为指标，建立含量测定法，方法操作简单、测定准确、结果重现性好，对今后蒙松萝配方颗粒的上市和有效成分的质量控制及评价具有重要意义。

1、仪器、试药及耗材

1.1仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪（SPD-20A型紫外检测器）；昆山市超声仪器有限公司KQ500DE型超声波清洗机；赛默飞AUW220D型电子天平；

1.2试剂与试药：松萝酸对照品购于乐美天医药/德思特生物，批号：DSTDS004401（含量：98.0%）；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯；蒙松萝配方颗粒由内蒙古祈蒙药业提供。

2方法学试验

2.1溶液的制备

2.1.1对照品贮备液的制备: 取松萝酸对照品（含量：98.0%）约20mg，置50 ml量瓶中，精密称定，加甲醇适量，以150W功率超声处理20分钟使对照品溶解，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，为松萝酸对照品贮备液（0.4002mg/ml）。

2.1.2供试品溶液的制备：取蒙松萝配方颗粒，研磨成细粉，细粉过65目筛（四号筛），取约0.14g，精密称定，置碘量瓶中，加甲醇100ml（用单刻线移液管精密加入），密塞，称定重量，超声处理20分钟使溶解，放冷，再次称定，加入一定量的甲醇以补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液为供试品溶液。

2.1.3 阴性样品溶液的制备：重复“2.1.2”项下方法制备操作，将所用样品替代为不含蒙松萝原药材的样品（以相同工艺并按处方比例制备的阴性样品），即得。

2.2色谱条件与系统适用性试验:色谱柱: 安捷伦ZORBOX C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；以5%冰醋酸溶液-乙腈（22:78）为流动相；1.0mL/min流速；进样量:10μL；柱温:30℃；检测波长:254nm。分别精密吸取松萝酸对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10μL，在上述色谱条件下进样测定，理论板数按松萝酸峰计算不低于3000。色谱图见图1。

A

B

C

A.松萝酸对照品色谱图 B.样品色谱图 C.阴性样品色谱图

图 1 高效液相色谱图

2.3线性范围考察：精密量取2.2.1松萝酸对照品贮备液0.50ml、1.00ml、2.00ml、4.00ml、8.00ml分别置于10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即为系列浓度的对照品溶液；精密吸取上述对照品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，按2.2色谱条件进行测定；以各浓度对照品溶液的进样量（以对照品质量计，μg）为横坐标X，以测得的对照品峰面积为纵坐标Y，进行线性拟合。回归方程为：Y=2149907.4x+40146.4，r=1.0000，结果表明松萝酸的进样量在0.2001μg～3.202μg的范围内线性良好。

2.4精密度试验：按“2.3”项下色谱条件，取“2.1.2”项下供试品溶液，连续进样6次，列出各次峰面积的值，以计算出的RSD值为指标，考察精密度；结果表明仪器精密度良好（松萝酸峰面积的RSD为0.14%）。

2.5重复性试验：取同一批号（KL20220601）试验蒙松萝配方颗粒粉末（过四号筛）6份，按2.1.2供试品溶液制备项下方法，制备重复性试验溶液，进样测定；结合标准曲线数据计算。结果表明，本试验方法重复性良好（松萝酸峰面积的RSD=0.25%，n=6）。

2.6稳定性试验：取批号KL20220601试验蒙松萝配方颗粒供试品溶液10μl，分别于不同时间（0h、4h、8h、16h、24h）精密注入液相色谱仪进行测定。结果表明，供试品溶液在24小时内稳定性良好（松萝酸峰面积的RSD=0.14 %，n=5）。

2.7回收率试验：取研细并过筛后的蒙松萝配方颗粒粉末（批号KL20220601，含量：5.67%）9份，每份约0.7g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，分别加入“2.1.1”所述的松萝酸对照品贮备液（0.4002mg/ml）5.00ml、10.00ml、15.00ml，各3份，按“2.1.2”项下方法制备阳性供试品溶液。按2.2色谱条件进行测定，进样体积10μl，结合标准曲线计算回收率。结果表明本方法回收率（加样回收）符合要求，结果数据见表1。

表1松萝酸回收率试验结果（n=9）

2.8耐用性试验：取对照品溶液和三批供试品溶液用不同厂家（资生堂CAPCELL PAK C18、飞诺美Ｌuna C18和安捷伦ZORBAX C18）色谱柱，按2.2色谱条件测定松萝酸含量，结果松萝酸含量的相对偏差分别为0.5%、0.9%、0.9%，表明耐用性良好。

2.9样品测定

取试验蒙松萝配方颗粒粉末（3批）（过四号筛），按上述建立好的方法对蒙松萝配方颗粒进行含量测定，松萝酸含量平均值为5.28%（3批样品含量范围5.04%～5.67%），3批样品含量均在平均值的95.5%～107.4%范围内。结果见表2。

表2  样品中松萝酸含量测定结果

3 讨 论

3.1 参照《内蒙古蒙药饮片炮制规范》2020年版“蒙松萝”项下含量测定的方法[1]，结合松萝酸理化性质及实际试验，选择甲醇作为提取溶剂，选择254nm作为检测波长。

3.2 供试品溶液中松萝酸色谱峰与对照品溶液松萝酸色谱峰保留时间一致，阴性对照色谱中在上述保留时间相对应的位置处无色谱峰出现，表明其他组分对松萝酸测定无干扰，采用本试验选择的色谱条件对蒙松萝配方颗粒进行色谱分离，在与松萝酸对照品溶液相同保留时间处的色谱峰均为单一峰，故在本试验选定条件下松萝酸得到有效分离。

3.3本试验分别考察了超声处理10min、15min、20min和25min等不同超声时间对提取效率的影响，结合标准曲线数据计算含量，数据表明超声提取20分钟松萝酸的含量基本不再增加，故确定超声时间为20分钟。

3.4本文建立了一种简便、快速、准确、重现性好的定量方法，通过对松萝酸的含量测定，达到控制该制剂质量的目的。

参考文献

[1] 内蒙古蒙药饮片炮制规范[M].呼和浩特：内蒙古人民出版社，2020版：471.

[2] Cansaran D，Cetin D，Halici MG，et al．Determination of usnic acid in some rhizoplaca species from middle anat olia and their antimicrobial activities［J］．Z Naturforsch，2006，61（1-2）：47-51．

[3] Fournet M,Elena F.Antonieta R A,et al.Activity of compounds isolated from Chilean lichens against experimental cutaneous leish-maniasis[J].Alain. Comp .

Biochem.Physiol,1997,116(1):51-54.

[4] 殷乐章，李伟．松萝酸生物活性和毒性研究进展［J］．辽 宁 中 医 药 大 学 学 报，2018，20(12):96-100．

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典:四部[S].北京：中国医药科技出版社，2020：480.

通讯作者简介：张德瑞，男，1978年生人，大学本科，副主任药师，赤峰市产品质量检验检测中心药品检验室，主要从事药品的检验检测及相关科研工作。

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