鸡蛋中抗病毒类药物快速检测研究

鸡蛋中抗病毒类药物快速检测研究

钱博 游松 王丽娜

沈阳药科大学

摘要

背景：实验通过对鸡蛋的主要成分和抗病毒药物的结构性质进行探讨，在其他基质试验经验中，得出较为快速合理的提取和净化步骤，结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）仪器分析，在液相色谱柱的筛选、梯度洗脱溶液及顺序参数、质谱条件等进行优化，对鸡蛋中残留的金刚烷胺、金刚乙胺进行内标法定量分析检测，以达到快速的检测技术。方法：在5g鸡蛋样品中，加入三氯乙酸-乙腈（9：1）混合提取液15mL，超声10min，漩涡3min，高速离心机恒温20℃下10000r/min离心5min。净化步骤为：活化过的PCX小柱中依次加入净化液2%甲酸5mL、1%甲酸乙腈3mL，真空抽干PCX小柱，用4mL氨水-乙酸铵-甲醇混合溶液进行洗脱，氮气浓缩仪50℃吹干，加入1mL溶解液0.1%甲酸甲醇与水，涡旋混合30s后过0.22μm膜。结果： 在1，2，5，10μg/kg加标梯度下，两种抗病毒药物的平均回收率在80%以上，金刚烷胺的回收率高达85%，RSD为0.118~0.187；金刚乙胺的回收率为81%~98%， RSD为0.038~0.134。两种抗病毒药物的标准曲线在0~20μg/kg中呈良好线性关系，R2≥0.999。

关键词：液相色谱-串联质谱法；金刚烷胺；金刚乙胺；鸡蛋

1背景

两种抗病毒药物金刚烷胺、金刚乙胺都属于三环胺类。1964 年Davis等首先报道金刚烷胺的抗病毒效果，1966年亚洲感冒爆发同时其治疗药在美国上市， 10年后在预防药的基础上确认为治疗药。接连载入英、美、日、中的药典，1971年中国获批生产。金刚烷胺的同位体之一，金刚乙胺，由美国Bristol—Myers Squibb公司研发，可通过乙胺基代替金刚烷胺的NH而得。

2 实验方案设计

2.1 标准储备液配制

根据下表的纯度或规格，计算出所需用量，精确称量所需的金刚烷胺、金刚乙胺、金刚烷胺-D6、美金刚-D6，分别置于四个10 mL容量瓶中，用甲醇溶解至刻度线，配制成100μg /mL的标准储备液，并转移到带标签的棕色玻璃瓶，在-18℃的条件下储存，有效期6个月。实验时，用甲醇按需稀释，配制成混合标准工作溶液。金刚烷胺、金刚烷胺-D6、金刚乙胺、美金刚-D6，四种标准品的相关信息，包括英文名，存放条件，纯度或规格，生产商等见表2.1。

表2. 1 四种标准品相关信息

2.2　标准中间溶液的配制

准备四个洁净的10mL容量瓶，用移液器准确移取0.1mL的2.1标准储备液，甲醇稀释至刻度线，配成浓度为1μg /mL的混合标准中间液和混合内标中间液，转移到带标签的棕色玻璃瓶，置于-18℃条件下保存，有效期3个月。实验时将以上溶液取出，放置到室温，轻轻晃动几秒后，移取适量的中间内标溶液和中间标准溶液，用乙腈稀释，配制成质量浓度分别为0，1，2，5，10，20μg /kg的标准工作液。

2.3 实验所需溶液

实验前把提取和净化所需的溶液按照表2.2配制好，装进贴好标签的玻璃瓶，室温下储存以备用。

表2.2各种溶液的比例/浓度

2.4 实验基质

本实验以鸡蛋为基质，对残留的两种抗病毒药物金刚烷胺、金刚乙胺进行检测、分析。因此我们需要在实验前，准备好鸡蛋样品，鸡蛋是本实验室平时实验的样品，无特定添加。在实验室将鸡蛋打碎去壳，蛋黄和蛋清用组织搅碎机搅拌均匀，倒入带标签的洁净的密封袋，密封冷冻储藏。基质制备过程，尽可能地阻止外界干扰，保护基质不受污染，防止残留物含量的变化。

3 液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）实验

3.1 液相色谱条件

液相色谱条件及参数见表3.1。

表3.1液相色谱条件及参数

梯度洗脱条件见表3.2。

表3.2梯度洗脱条件

3.2质谱条件

质谱条件检测方式及参数如表3.3。

表3.3质谱条件检测方式及参数

两种抗病毒药金刚烷胺、金刚乙胺以及内标物的定量监测分析参数如表3.3。

表3.3抗病毒药及内标物的多反应离子监测分析参数

4 结论

本设计用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析方法，快速测定鸡蛋中两种金刚烷胺、金刚乙胺残留量。通过查阅相关文献，比较各种试剂与材料，确定合适的提取和净化方法，同时改进仪器的各种参数，达到快速简便的检测目的，对抗病毒药物残留的检验提供一定的参考价值。

实验确定：在5g鸡蛋样品中，加入三氯乙酸-乙腈（9：1）混合提取液15mL，超声10min，漩涡3min，高速离心机恒温20℃下10000r/min离心5min。取5mL上清液于活化过的PCX小柱，依次加入净化液2%甲酸5mL、1%甲酸乙腈3mL，真空抽干PCX小柱，用4mL氨水-乙酸铵-甲醇混合溶液进行洗脱，氮气浓缩仪50℃吹干，加入1mL溶解液0.1%甲酸甲醇与水，涡旋混合30s后过0.22μm膜。液相色谱-串联质谱法测定，采用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1mm×100mm，1.7μm）色谱柱分离，电喷雾正离子模式多反应检测，内标法定量。

结果表明：两种抗病毒药物金刚烷胺、金刚乙胺，在0~20ng/mL范围内，呈良好的线性关系，R2≥0.999；加标回收率平均值≥80%。

   参考文献

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