miR-95-3p通过负调控CPSF4参与非小细胞肺癌发展

miR-95-3p通过负调控CPSF4参与非小细胞肺癌发展

孙党泽、韦林、刘玉钢、吴蔚童、丁超

西安市胸科医院 陕西 西安 710061

摘要

目的：研究miR-95-3p在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达和生存预后关系，阐明miR-95-3p异常表达参与NSCLC发生发展的分子机制。

方法：荧光定量PCR检测45例NSCLC以及正常肺上皮细胞BEAS-2B和非小细胞癌细胞系（PC9、A549 和 H1650）中miR-95-3p的表达丰度；随访收集入组的45例NSCLC患者5年的生存预后情况，并分析患者的生存预后与肺癌组织miR-95-3p 表达丰度之间的关系；组化检测入组患者癌旁和癌组织中CPSF4的表达。结果：相较癌旁组织miR-95-3p在癌症组织中特异高表达（P<0.001）。结论：miR-95-3p通过负调控CPSF4与NSCLC患者的生存预后负相关，可以作为预后判断和临床诊断的标志物。

关键词：微小RNA-95-3p；非小细胞肺癌；肺癌；生存预后；CPSF4

肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，死亡率很高1。目前尚未完全明确其复杂的发生机制。作为生物体重要的一类调控分子，microRNA在肺癌中存在失控表达2。自let-7簇被发现差异表达并且在肺癌发生、发展具有重要功能以来3，microRNA引起人们极大兴趣，多个研究小组对与肺癌密切相关的众多microRNA进行了研究，对其靶基因和功能有了基本的了解4。本研究旨在探讨miR-95-3p在非小细胞肺癌中的作用及其与患者生存预后的关系以及发挥作用的分子机制。

1 材料方法

1.1 入组患者标准 本研究纳入的45例NSCLC患者均来自西安市胸科医院2012年8月至2017年8月期间确诊NSCLC并行外科手术切除的患者，电话跟踪随访手术出院患者5年的生存情况。入组的患者均没有家族肿瘤病史，且入院前未进行过放疗或者化疗治疗，且均签署了知情同意书。

1.2 细胞培养 BEAS-2B、PC9、A549 和 H1650细胞株均购买自武汉普诺赛公司，且均通过STR鉴定。37℃，5% CO2，饱和湿度下细胞培养箱培养。采用DMEM培养基（购自Gibco公司）培养A549细胞，RPMI-1640培养基培养PC9和H1650细胞，DMEM/F12培养BEAS-2B细胞。培养基均加入10%胎牛血清（购买资杭州四季青公司）和1%青霉素-链霉素双抗（购自杭州碧云天公司）。

1.3 荧光定量PCR

采用诺唯赞的miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒进行荧光定量PCR检测。miR-95-3p的引物根据已有的文献报道（5′-CTGGTGGAGGGATGGATGAA-3′，5′-GGCCCGATCACAAACTCATC-3′），内参选用U6（5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′）引物合成自上海金斯瑞公司。20μL反应体系：2×mix 10μL，正反引物各0.4μL，模板cDNA 1μL，ddH2O 8.2μL。

1.4 统计学分析 采用GraphPad Prism 8软件和Excel 2020对数据进行非配对t检验。* P< 0.05; **P<0.01; ***P< 0.001), NS,没有统计学差异。生存分析采用Kaplan-Meier生存分析法。

2 结果

2.1 miR-95-3p在NSCLC患者肺癌组织和肺癌细胞系中的表达 我们提取了入组的45例NSCLC患者的冰冻癌组织和癌旁组织的RNA，利用荧光定量PCR检测分别检测其表达丰度，结果显示相较癌旁组织miR-95-3p在癌症组织中特异高表达（P<0.001），癌组织中的表达丰度平均是癌旁组织中的5倍以上，具体见图1，相比较正常肺上皮细胞系miR-95-3p在所有的肺癌细胞系中均呈现高表达模式。

3 讨论

异常表达的microRNA在肺癌发生、发展中具有重要调控作用，提示它在肺癌临床各个方面具有很大的潜能。由于高质量CT的不普及和一定的误诊率等原因，进而导致肺癌的早期诊断率非常低。microRNA在外周血、痰液和呼出气的稳定存在和高质量microRNA的检测方法使得microRNA有希望成为很好的早期诊断指标。治疗方面，肺癌发生、发展关键步骤存在microRNA的调控既是将来新的药物靶点的研究方向、耐药相关microRNA的确定又使得优化已有的药物成为可能。

4 结论 我们的研究证实miR-95-3p可能是NSCLC的癌基因，可能通过负调控CPSF4蛋白发挥作用。

参考文献/References

1Dunne, E. G. et al. The Emerging Role of Immunotherapy in Resectable Non-Small Cell Lung Cancer.

Ann Thorac Surg, doi:10.1016/j.athoracsur.2024.01.024 (2024).

2Zhu, X. et al. Frontiers of MicroRNA Signature in Non-small Cell Lung Cancer. Front Cell Dev Biol 9, 643942, doi:10.3389/fcell.2021.643942 (2021).

3Wu, K. L., Tsai, Y. M., Lien, C. T., Kuo, P. L. & Hung, A. J. The Roles of MicroRNA in Lung Cancer. Int J Mol Sci 20, doi:10.3390/ijms20071611 (2019).

4Ali Syeda, Z., Langden, S. S. S., Munkhzul, C., Lee, M. & Song, S. J. Regulatory Mechanism of MicroRNA Expression in Cancer. Int J Mol Sci 21, doi:10.3390/ijms21051723 (2020).