肾癌细胞中脑硫脂异常代谢对m6A甲基化的影响及机制

肾癌细胞中脑硫脂异常代谢对m6A甲基化的影响及机制

秦亮

上海市闵行区中心医院  泌尿外科  201199

[摘要]目的：m6A甲基化是20世纪70年代被发现的一种RNA分子上的甲基化修饰，存在于各种RNA中，但主要在mRNA中出现。与DNA甲基化相似，m6A甲基化也以在不改变碱基序列的情况下对基因的转录后表达水平具有调控作用。它主要是通过影响mRNA与读取蛋白的结合，从而调控mRNA的可变剪接、翻译效率和稳定性等，进而改变基因表达。研究早期，受限于m6A甲基化位点的检测技术不够灵敏，转录组中的m6A位点无法被完整而有效地鉴别。随着二代测序与生物信息学的发展，已有多种方法可以对m6A甲基化位点进行检测和预测。目前的研究表明，m6A甲基化与肿瘤的发生发展也密切相关。本文结合近期的研究进展，对m6A甲基化的概念、检测和预测手段，特别是m6A与肾癌细胞发生之间的关系进行了综述，旨在为肾癌细胞的分子病理诊断和分子靶向治疗寻找新方向。

[关键词]m6A甲基化；髓超嵌体；缺损修复；应用效果

肾细胞癌是泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤。美国最新的肿瘤数据报道，肾癌是男性肿瘤中占第六位，每年有65000个新发病例，并导致每年15000患者死亡。肾透明细胞癌（clearcellrenalcellcarcinoma，ccRCC）是最常见的一类肾细胞癌占80%[1]。临床实际中，有16%的ccRCC在初诊时被发现已出现转移，其5年生存率12%。虽然ccRCC的肿瘤学研究及手术治疗发展很快，但ccRCC的预后没有明显的改善。对于局部的ccRCC，20%-30%的患者在初次手术治疗后发生复发，目前未证明任何治疗可减少肿瘤复发及改善预后。近年来，靶向药物被证明可延长转移患者的生存与后，但中位生存期仍少于3年。此外，肿瘤耐药和经济负担是临床实践中的两大问题。因此，关于ccRCC的病理机制和新的治疗靶点的研究仍是具有挑战性的探索[2]。脑硫脂(SFT)是一种酸性鞘糖脂，近年发现它表达于胰岛B细胞，与胰岛素的合成、储存和释放过程关系密切，目前有关SFT与m6A甲基化关系的研究国内未见报道。

1.1 m6A甲基化的相关概念

RNA的m6A甲基化是腺嘌呤(A)第6位N通过甲基转移酶催化形成的一种甲基化修饰。m6A甲基化在mRNA上最为常见，同时也可以出现在转运RNA(transferRNA,tRNA)、核糖RNA(ribosomeRNA,rRNA)甚至非编码RNA(non-codingRNA,ncRNA)中[6]。也有研究发现m6A甲基化可出现在多个常见的长链非编码RNA(longnon-codingRNA,LncRNA)中，如MALAT1、HOTAIR、XIST和SRA1。值得关注的是，m6A甲基化不但可以通过影响微小RNA前体的生成来改变微小RNA的表达，m6A甲基化同样可以出现在成熟的微小RNA中。大量的研究证明，m6A甲基化主要与3类蛋白质相互作用。第一类是m6A甲基转移酶，它会促进RNA中的m6A甲基化修饰，其编码基因被称为写入基因(Writers)，最早发现的写入基因有METTL3、METTL14和WATP等，它们形成的复合物共同促使m6A甲基化基团写入RNA中。随后发现METTL16、KIAA1429和RBM15等更多新的写入基因。第二类蛋白质是m6A去甲基酶，它可以去除RNA中的m6A甲基化基团，其编码基因为擦除基因(Erasers)，常见的擦除基因有FTO和ALKBH5。由此可见，m6A甲基化其实是一个动态、可逆的过程。最后一类蛋白则能够与RNA中的m6A甲基化位点结合进而发挥特定作用，它们的编码基因被称为读取基因(Readers)。最早发现的读取基因是YTH结构域家族蛋白的编码基因，包括YTHDFs和YTHDCs两个亚型。YTHDCs亚型中的读取基因为YTHDC1和YTHDC2。而YTHDFs亚型的读取基因分别为YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3。除了YTH结构域家族蛋白基因，随后又有多个读取基因被发现，别为eIF3、hnRNPC和hnRNPA2/B1基因。读取蛋白会与RNA上的m6A位点结合，进而产生各种生物学功能。目前对于m6A甲基化的生物学功能尚未完全了解，但已有研究发现YTHDFs亚型的蛋白质主要定位在细胞质中，YTHDF1和YTHDF3蛋白会提高mRNA的翻译效率，而YTHDF2蛋白与m6A位点结合则与缩短mRNA的半衰期有关。但是，也有研究发现YTHDF2蛋白会在核内通过与m6A位点结合以阻止FTO蛋白去除5'UTR区的m6A甲基化进而促进RNA的帽非依赖性翻译。而YTHDCs亚型的蛋白质则主要在核内发挥功能。有报道显示，YTHDC1蛋白对编码和非编码基因的转录都具有调控作用，且可通过影响mRNA前体的可变剪接来调控mRNA的表达水平。目前对于YTHDC2与m6A甲基化的功能了解甚少，有文献报道YTHDC2蛋白在核内核外均可存在，且会选择性地与非编码RNA上的m6A位点结合，但所产生的生物学功能依然是一个谜

[3]。另外，在hnRNP家族中发现hnRNPA2/B1蛋白可能参与了前体miRNA转录的调控过程，而hnRNPC蛋白则会影响mRNA和LncRNA的局部二级结构。由此推测，m6A甲基化很可能参与了更为广泛的生物学调控过程。目前，与m6A甲基化有关的新的写入蛋白和读取蛋白依然在源源不断地被人们鉴别出来，可见人们对RNA上m6A甲基化水平的动态调控以及潜在的生物学调控功能依然有非常广阔的探索空间。期望未来，人们可以更全面地了解m6A甲基化的生物学功能，使表观遗传在对于转录后层面的基因表达有更多的认识和补充。

1.2 m6A甲基化的检测方法

早期由于检测技术落后，科研工作者们对于m6A甲基化位点知之甚少。由于RNA的m6A甲基化并不影响其逆转录，也不能像m7G甲基化那样可以被特异性地切割，以至于m6A位点的鉴别在初期研究中显得非常困难。但随着二代测序的出现，两种相似的m6A甲基化位点检测技术应运而生，这就是m6A-seq和MeRIP-seq技术。这两种检测方法其实是应用免疫共沉淀技术将具有m6A甲基化的RNA片段捕捉后再使用二代测序来鉴定其序列。随后，大量的m6A甲基化位点被发现，科研工作者分别在人和小鼠的7000余个基因中发现了多达12000个m6A信号峰，这些信号峰都富集在靠近3'端的终止密码子附近，且发现这些位点在人和小鼠中都具有高度保守性[4]。这一发现为m6A甲基化在转录后对与基因表达水平的调控提供了有力证据，且可能与各类遗传疾病有关。这种检测手段的缺陷是该技术所捕获的RNA片段被限制在100~200nt左右，并且该技术无法识别两个非常接近的m6A位点，所以这种方法不能对全转录组的m6A甲基化位点作出精准的鉴别。另外有文献报道，在mRNA中的5'端含有m6Am修饰，因为m6A修饰同m6A修饰一样具有第六位甲基，因而m6A-seq和MeRIP-seq都可能将这种修饰误读为m6A修饰。由于以上种种原因，人们对检测技术做出了改进。紫外交联免疫共沉淀技术可以更为精确地在RNA的单个碱基上去捕捉m6A甲基化位点。这3种相似的技术分别为miCLIP、PA-m6A-seq和m6A-CLIP(或称为UV-CLIP)。另有一项检测m6A甲基化水平的技术为m6A-LAICseq，这项技术在m6A-seq的基础上引入了spike-inRNAs作为内参，从而计算出全转录组中每段基因上的m6A甲基化水平，其缺点是无法检测出单个m6A甲基化位点。除了高通测序外，单基因的m6A甲基化位点检测手段也非常重要。其中最有名的当属SCARLET检测法。这种方法可以在mRNA和LncRNA中精确地检测单个m6A甲基化位点，并由此计算出整段RNA的m6A甲基化水平。虽然SCARLET属于低通量检测且费用较为昂贵，但极高的精准性使其成为用于检验高通量检测m6A甲基化位点的准确性的一种常用方法。也有文献报道，SCARLET同样可以用于检测其他类型的RNA表观遗传修饰，例如RNA的m5C修饰和Ψ修饰。荧光定量PCR同样也可以作为检测m6A甲基化水平的方法。在同一种RNA中不同的m6A甲基化水平在荧光定量PCR检测下会产生不同的熔解曲线，这是由于m6A甲基化水平的不同使RNA-DNA复合物的熔解温度发生改变。由此作者提出了HRM检测方法，该技术可以在RNA中检测已知的m6A甲基化水平是否发生变化。但是该技术能否推广到其他RNA中还有待验证。时至今日，高通量测序技术已经非常成熟，但荧光定量检测依然是目前最为经济和便捷的分子检测手段之一，开发荧光定量PCR用于m6A的检测仍然非常重要。随着m6A甲基化位点的检测手段的逐步提高，人们对其认识日渐深入，从而为研究m6A甲基化与各类疾病特别是与肿瘤的关系打下坚实的基础。

1.3 m6A甲基化位点的预测方法

由于m6A甲基化位点的检测需要花费大量的人力物力，而通过生物信息学预测则可以极大地提高研究效率。近年来，生物信息学发展迅速，在各类分子生物学的研究中应用广泛，以下几种方法可以帮助人们更有效地预测m6A的甲基化位点。最早使用隐藏马尔科夫模型来预测已知位点周边的残余位点。随后又衍生了更快速更稳定的pRNAm-PC方法来预测位点。两者的共同特点是都应用了支持向量机(supportvectormachine,SVM)模型。在此基础上，RNA-methylPred方法，这要比前两者更为稳定和高效。这种方法可以更有效地在哺乳动物的RNA中预测m6A甲基化位点。近期有文献报道名为RMBaseV2.0数据库网站已经建立(网址http://rna.sysu.edu.cn/rmbase/)，其收录了13个物种的多个RNA表观遗传修饰的测序数据，其中包括了大量关于m6A的甲基化位点的数据。

2.1 m6A甲基化与肿瘤

在早期的基础研究中，已有国内学者发现m6A甲基化参与了脊椎动物的造血干细胞的分化过程，这提示m6A甲基化很可能与血液系统肿瘤的发生发展有着密切联系。研究发现METTL3基因对小鼠和人的多种急性髓细胞白血病(acutemyelocyticleukemia，AML)细胞系的增值和生长均有不同程度的影响，其中对小鼠KMT2A–MLLT3融合基因及Flt3基因内部串联复制型的AML细胞系影响最为明显。研究发现，METTL3基因表达下调会促进AML细胞的分化，由于转录因子CEBPZ调控METTL3的表达上升，从而使癌基因SP1所转录的mRNA上的m6A甲基化水平明显上升，最终导致SP1蛋白表达量升高。同时发现，SP1蛋白可以持续影响造血干细胞向AML细胞分化。这一研究提示METTL3基因可能成为KMT2A–MLLT3基因和Flt3基因突变型AML的潜在治疗靶点。Vu等也报道了METTL3与AML的发生发展有关。该研究发现，对CD34

+的造血干细胞的METTL3基因下调后，该细胞的pAKT基因的表达上升，从而起到促进正常造血干细胞分化为AML细胞的作用，反之则会产生抑制作用。同时研究还发现，m6A甲基化会促进该细胞中c-MYC、BCL2和PTEN等基因的转录。也有研究发现，METTL14基因在正常的造血干细胞和混合表形AML细胞(伴t(11q23)、t(15;17)或t(8;21))中呈高表达但在正常分化的骨髓细胞中则呈现低表达。METTL14基因编码写入蛋白，其升高会导致某些转录组中的m6A甲基化水平升高。该研究在AML细胞系中发现，敲低METTL14的表达会降低MYB和MYC所转录的mRNA的稳定性，使其加速降解。这说明，MYB和MYC受到了METTL14的调控。METTL14对造血干细胞分化为AML细胞有一定的作用，并在白血病的进展、维持和自我更新等方面都有一定作用。该研究还发现，沉默METTL14的表达可以有效地抑制AML细胞系的增殖。这一研究揭示了SPI1-METTL14-MYB/MYC通路对AML的影响，为AML的诊断和治疗提供了新的方向。有研究发现METTL3会改变抑癌基因SOCS2的m6A甲基化水平[5]。并且METTL3过表达会促进肝细胞癌(HCC)的增殖和迁移，而降低METTL3则会抑制细胞的生长和转移。他们在进一步研究中发现，SOCS2在HCC中表现为抑癌基因，而METTL3通过调控m6A-YTHDF2通路，进而加速SOCS2的mRNA的降解，这项研究证明m6A高甲基化与HCC的发生发展也具有相关性。

在MLL基因重排的AML中高表达的FTO可以降低ASB2和RARA基因的mRNA中m6A甲基化的水平从而引起AML的发生发展，同时发现高表达的FTO会抑制全反式维A酸介导AML细胞向正常血细胞分化的作用。这使得FTO这一去甲基化基因成为了MLL型AML的癌基因。有研究发现在宫颈鳞状细胞癌(cervicalsquamouscellcarcinoma，CSCC)患者的肿瘤组织中FTO表达显著升高，并发现这些患者对放化疗产生了耐受，这可能是由于FTO降低了某些基因的m6A甲基化水平进而激活β-catenin通路并影响到了ERCC1基因的表达而产生的作用。同时发现，CSCC患者中FTO和β-catenin表达同时升高相比较单独升高的患者，表现出了更差的预后(P=0.041)。由此可见，FTO和β-catenin的表达对于CSCC的临床预后具有一定的评估价值。由于肿瘤中的m6A甲基化水平的高低往往取决于转甲基酶和去甲基酶的水平，所以研究肿瘤中这两种酶的基因表达水平有助于深入了解肿瘤的发生发展与m6A甲基化的相关性，帮助建立肿瘤早期诊断及预后分析的新方法。

2.2 m6A甲基化与脑硫脂异常代谢

SFT可以显著增加KATP的活性，诱导B细胞休息可能是SFT的保护机制之一。SFT可以抑制炎症因子的产生。提示SFT可能在胰岛内发挥局部抗炎作用，抑制炎性因子对8细胞的损害。补充C16：OSFT(含有16碳饱和脂肪酸的分子称为C16：0亚型SFT)可以改善Zucker肥胖大鼠的8细胞功能。对SFT的深入研究有助于人们对胰岛B细胞生理功能的认识[6]。

3结语与展望

m6A甲基化作为众多RNA表观遗传修饰家族中的一员，基于目前对其与肿瘤的认识，其本身并无“好坏”之分，主要通过调控相关的癌基因或抑癌基因的mRNA表达量起到对肿瘤细胞的促进或抑制作用。随着人们对m6A甲基化机制的研究逐渐深入，发现与其相关的RNA水平的调控变得更加复杂和多样。有趣的是，读取蛋白结合m6A甲基化位点后，既可能促进相关mRNA的表达，也可能降低相关mRNA的稳定性而加速降解。此外，非编码RNA可以调控目的基因的表达水平，而m6A甲基化出现在非编码RNA中，又会调控非编码RNA本身的表达水平。m6A甲基化这种双面调控行为特别是对于非编码RNA的调控，也许能够帮助人们从新角度去阐明一些原本无法解释的问题。肿瘤干细胞是一种获得了多能性的肿瘤细胞，其恶性程度极高，拥有自我更新能力使其能更快地突变以产生耐药能力或适应微环境的改变。研究发现，目前有一定数量的m6A甲基化与肿瘤的研究都与肿瘤干细胞有关，这为人们对于肿瘤干细胞的认识提供了一个新的视角，并对于更全面地理解肿瘤细胞的发生发展和突变提供了很好的帮助，也为对肿瘤干细胞相关肿瘤的治疗指引了新的方向。如今，肿瘤的诊断和治疗已步入了分子时代，肿瘤的分子诊断现已广泛开展，分子靶向药物的研制也取得了一定的突破。对于不同肿瘤中m6A甲基化位点的研究可以帮助医疗工作者们寻找新的分子诊断位点。另外，RNA中的m6A甲基化水平与细胞内写入、擦除基因的表达量密切相关，而读取基因表达的蛋白分子则与m6A甲基化位点相结合从而执行一系列生物学功能。所以在肿瘤中，无论是m6A相关的基因还是蛋白的表达水平改变都将有可能成为肿瘤分子诊断的潜在标志物，同时也将为临床分子靶向治疗药物的研发提供新的靶点。

参考文献

[1]俊昌．刘又宁．陈良安．抗利尿激索分泌异常综合征(附16例报告)[J]．北京医学，2004，26(6)：379-381．

[2]赵娟娟，韦四喜，严芝强，等．胃癌长链非编码ＲＮＡＳＮＨＧ１６异常表达及其临床病理意义［Ｊ］．东南大学学报，2017 36(4):551-554．

[3]李帅，张炳东．细胞凋亡途径的研究进展[Ｊ]．山东医药，2017,57 (37) :103-106．

[4]张笑,贾桂芳.RNA表观遗传修饰：N 6-甲基腺嘌呤.遗传,2016,38(4):275–288.

[5]隗思媛，孟畅，李淑艳．长链非编码RNA的功能与疾病治疗的潜力[J]．中国生物化学与分子生物学报，2018，34(2)：129—136．

[6]余明桔，王婷，张妮和．外泌体在胃癌发生发展中作用的研究进展[J]．中国肿瘤生物治疗杂志，2018，25(11):1154—1158．

课题编号：2021MHJC06