桂枝加桂汤对三氧化二砷诱导H9c2细胞损伤的保护作用研究

桂枝加桂汤对三氧化二砷诱导H9c2细胞损伤的保护作用研究

苏姗

保定市第一中心医院医院 河北 保定 071000

【摘要】 目的：通过细胞实验方法观察桂枝加桂汤对ATO诱导心肌细胞损伤的炎性反应、氧化应激、线粒体膜电位、ROS、LHD和CK含量的影响，考察桂枝加桂汤对ATO诱导心肌增殖毒性的保护作用以及桂枝加桂汤对ATO心脏毒性的保护与抗氧化应激和缓解线粒体损伤相关机制。结果：桂枝加桂汤能显著增强ATO诱导的H9C2细胞活性、显著降低LDH水平，用药组线粒体膜电位水平显著高于 ATO 组，ROS 水平显著低于 ATO组。结论：桂枝加桂汤对 ATO 导致的心肌损伤具有保护作用，其机制可能与抑制氧化应激、炎性因子和降低细胞膜损伤减轻心肌毒性有关。

【关键词】ATO、桂枝加桂汤、心肌细胞损伤

桂枝加桂汤出自于《伤寒论·辨太阳病脉证并治》：“烧针令其汗，针处被寒，核起而赤者，必发奔豚。气从少腹上冲心者，灸其核上各一壮，与桂枝加桂汤，更加桂二两也。”本方即桂枝汤重用桂枝五两而成。重用桂枝，意在温通心阳，以制肾水，共奏温通心阳，平冲降逆之功。方中药物为“桂枝五两(去皮)，芍药三两，生姜三两(切)，甘草二两(炙)，大枣十二枚(擘)”。现代药理学研究证实，桂枝加桂汤对心脏信号传导有积极改善作用，并对心律失常、心衰等多种心肌病有显著治疗作用。桂枝中所含的肉桂酸具有抑菌、利胆、抗突变、抗侵袭和抑制肺癌细胞恶性表达等药理作用；白芍中的芍药苷可以通过抑制单核细胞来减慢炎症的反应速率，从而发挥抗炎作用；有研究表明，6-姜酚是生姜的主要活性成分，极具药用价值，研究发现其有显著的抗炎、止痛、强心、抗氧化作用；甘草中的甘草苷可抑制氧化应激导致的细胞凋亡，甘草酸则可通过抑制氧化损伤来减少炎症因子的产生；大枣富含多糖、三萜类、皂苷类、生物碱类、黄酮类等，具有极高的营养及药用价值。桂枝加桂汤治疗砷剂诱导的心脏毒性目前为止没有明确的文献报道，因此本研究利用ATO诱导H9c2细胞模型，在细胞水平上初步探讨桂枝加桂汤对ATO诱导H9c2细胞损伤的保护作用，以期为该中医药汤剂在保护砷剂引起的心脏毒性治疗中的应用提供理论基础，并且对桂枝加桂汤的开发及应用具有深远意义。

1 资料与方法

1.1 主要试剂

桂枝加桂汤中药材（购于乐仁堂药业）、H9c2心肌细胞，购于 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)、注射用三氧化二砷（北京双鹭药业）、生理盐水（石家庄四药股份有限公司）、胎牛血清和DMEM（Gibco 美国）、CK试剂盒（南京建成生物科技有限公司）、LDH试剂盒（南京建成生物科技有限公司）、ROS试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）、DHE（美国Sigma有限责任公司）、DAPI（武汉塞维尔生物科技有限公司）、罗丹明123试剂盒（北京索莱宝）、PBS缓冲液（北京索莱宝科技有限公司，货号D1040）。

2 方法

2.1 桂枝加桂汤含药血清的制备

桂枝、生姜两味药材，用水蒸气蒸馏法提取其挥发油，收集，-20℃密封保存，备用。药渣与其他药味煎煮两次，过滤去渣，滤液浓缩，加入乙醇至其含量达50%，静置过夜、3500rpm离心5 min，倾取上清液，回收乙醇后，料液浓缩、冷冻干燥后-20℃密封保存。使用时用水溶解并加入挥发油（适量乙醇溶解）。桂枝加桂汤冻干粉（单剂组方的量）加53mL纯化水溶解稀释；桂枝、生姜挥发油用1 mL无水乙醇溶解后加入，混合均匀后SD大鼠灌胃给药。SD大鼠灌胃桂枝加桂汤7天后，第8天乙醚麻醉，无菌条件下腹主动脉取血，静置2 h以上，1500 r/min，离心15 min，10 min后取血清，按灌胃浓度分别混合，56 ℃，30 min灭活，分装，﹣20 ℃冰箱保存备用。

2.2 血清心肌酶CK和LDH指标检测

细胞经药物处理后，分别收集细胞上清液，使用LDH试剂盒检测其释放量。将收集的上清转移至6孔板中，每孔分别加入LDH检测工作液60 μl，室温避光摇床缓慢摇动30min。使用酶标仪测定490 nm处各孔吸光度。

结果

计算不同浓度（1、3、10、15、30µM·L-1）ATO对正常心肌细胞的存活率，结果显示：与空白对照组比较，不同浓度的ATO可显著降低细胞存活率（P<0.01），表明ATO可诱导心肌细胞损伤。随ATO浓度增大，细胞存活率不断降低，存活率呈浓度依赖性。其中，10µg·mL-1 ATO对细胞存活率达50%左右，故选用10µg·mL-1ATO作为心肌细胞损伤模型。

讨论

三氧化二砷（Arsenic trioxide，ATO）是剧毒药物砒霜的主要有效成分，早在两千多年前就被用于治疗银屑病、梅毒、结核等疾病[1-2]。研究表明，ATO是治疗复发性或难治性急性早幼粒细胞白血病（APL）最有效的药物之一[3]，被美国国立综合癌症网络确立为复发性APL的首选用药

[4]。ATO是治疗急性早幼粒细胞白血病（APL）和其它造血系统恶性肿瘤的常用药物，其疗效已在临床试验中得到证实[1]。高剂量 ATO 通常是用作治疗某些肿瘤的有效化疗药物，然而其本身的细胞毒性严重限制了ATO的临床使用。近十几年来，多项临床研究结果显示过量使用 ATO 可能导致肝毒性、肾毒性和心脏毒性[2-5]。桂枝加桂汤是我国广泛使用的传统中草药汤剂，具有温通心阳，平冲降逆的功效，临床上可治疗奔豚证。现代药理研究发现具有抗病毒、抗氧化、抗炎、抗菌等药理学活性。但桂枝加桂汤对ATO 导致心肌损伤的保护作用尚未见研究。 因此，本研究的目的是研究桂枝加桂汤对 ATO 导致的心肌损伤的保护作用并探讨其可能的作用机制。实验结果表明，ATO可显著降低H9C2细胞活性。

结  论

桂枝汤对 ATO 导致的心肌损伤具有保护作用，其机制可能与抑制氧化应激、炎症因子和降低细胞膜损伤减轻心肌毒性有关。该项研究为临床安全合理地运用该药提供了有益的借鉴。

参考文献

[1]陈亚娟, 卿晨. 三氧化二砷抗肿瘤作用研究进展[J]. 昆明医学院学报, 2012(1B):251-254.

[2] 高晶晶, 于小玲, 刘玉波, 等. 姜黄素灌胃对顺铂所致小鼠肝损伤的

防护效应[J]. 现代中西医结合杂志, 2010, 19(34): 4401-4403.

[3] 李海华, 青梅, 于娟, 等. 甘草的研究进展[J]. 内蒙古医科大学学报,

2015, 37(2): 199-204.

[4]欧明洪. 异甘草酸镁药理与临床研究进展[J]. 中国药业, 2010, 19(15):

83-85

[5] 池肇春.药物性肝损伤研究现状与进展[J]. 世界华人消化杂志, 2021,

29(16): 915-925.