miR-206对急性心肌缺血再灌注大鼠心肌Cx43蛋白表达的影响

miR-206对急性心肌缺血再灌注大鼠心肌Cx43蛋白表达的影响

李强  杨璧华 马添翼  钟赞蕊 张伟  唐史林

（海口市人民医院心血管内科，海南海口 570708）

海南省自然科学基金面上项目（编号820MS164）

[摘要]目的：观察miR-206对急性心肌缺血再灌注（MIR）大鼠大体模型左心室心肌Cx43蛋白表达的影响，探讨其可能的机制。方法：将40只大鼠随机分为：假手术组（n=10）、MIR组（n=10)、MIR+antagomir 组(n=10)、MIR+miRNA-NC组（n=10）。MIR各组采用传统的冠脉结扎法制作MIR模型，术后同等条件下喂养8周后，MIR组予以尾静脉注射生理盐水200ul，MIR+antagomir组注射同等体积miR-206拮抗剂antagomir，MIR+miRNA-NC组注射同等体积miRNA-NC，3天1次，连续4周。切取各组大鼠左室心肌分别作HE染色，提取心肌蛋白和RNA，分别做Western blot检测Cx43、pCx43、ERK1/2、JNK、P38、p-ERK1/2、p-JNK、p-P38、p-AKT、AKT、及P65等信号传导通路相关蛋白的表达；行RT-PCR检测miR-206表达。结果：1. MIR组大鼠miR-206的相对表达水平量明显高于假手术组（P＜0.05）；MIR+antagomir组的miR-206相对表达水平均较MIR组明显下降（P＜0.05）。2. 与假手术组比较，MIR组大鼠左心室心肌Cx43蛋白表达量明显降低（P＜0.05）；而MIR+antagomir组的左心室心肌Cx43蛋白表达量较MIR组明显增加（P＜0.05）。3.与假手术组比较，MIR组Cx43、pCx43蛋白表达均明显下调（P<0.05或<0.01），p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK、p-p38/p38、p-AKT/AKT等相关蛋白比值明显下降，而P65蛋白表达明显增加，两组间比较亦有显著性差异（P<0.05）。与MIR组比较，MIR+antagomir组的左心室心肌p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK、p-p38/p38、p-AKT/AKT等相关蛋白比值均明显增加，而P65蛋白表达明显下降（P＜0.05）。结论：miR-206可能通过MAPK信号通路参与MIR Cx43的调控，并减轻MIR心肌损伤。

关键词：miRNA-206；心肌缺血再灌注；大鼠；Cx43；MAPK

microRNAs在多种疾病中发挥重要作用，包括心肌的急性缺氧再灌注(MIR)损伤，然而，microRNAs在MIR损伤中的确切功能和作用目前尚不清楚。Cx43是心室肌中主要的缝隙连接（GJ）蛋白，与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信号通路相关。与此同时，miR-206已被实验证实直接靶向心肌Cx43和MAPK相关蛋白，我们推测，miR-206可以在MIR心肌损伤中发挥作用。我们通过在体大鼠动物实验，观察miR-206对MIR大鼠大体模型左心室心肌Cx43蛋白表达的影响，初步探讨其可能的机制。

1. 材料与方法

1.1实验分组和建模

将40只大鼠随机分为：假手术组（n=10）、MIR组（n=10)、MIR+antagomir 组(n=10)、MIR+miRNA-NC组（n=10）。大鼠术前8小时禁食，自由饮水。MIR模型采用传统的冠脉结扎法：用3%戊巴经耳缘静脉麻醉后，仰卧位，固定四肢，采用传统方法，开胸后在左冠状动脉前降支距房室沟约0.3mm处穿线，结扎左冠状动脉前降支，以心电图出现明显S-T段抬高为结扎成功，维持观察40分钟后，剪断结扎线，开始心肌再灌注。对照组按以上手术操作，但不做结扎冠状动脉处理，缝合，消毒。全部大鼠于术后肌注只青霉素10万U/kg抗感染，连续注射7天。术后每天观察并记录大鼠的基本情况，包括体重、精神状态、呼吸、饮水饮食、毛色、活动力等指标。术后同等条件下喂养8周后，MIR组予以尾静脉注射生理盐水200ul，MIR+antagomir组注射同等体积miR-206拮抗剂antagomir，MIR+miRNA-NC组注射同等体积miRNA-NC，3天1次，连续4周。处死大鼠摘取出心脏组织，选取一部分心肌进行病理HE染色，将切好左室心肌分别放入预先做好标记的Eppendorf 管中，然后置于-80℃冰箱冷冻保存待用后续进行Western blot及PCR检测。

1.2试剂和仪器

RNA快速提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；逆转录试剂盒、U6引物套装购自广州锐博生物有限公司；Cx43、p-Cx43、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-p38、p38、p-AKT、AKT等抗体均购自美国 CST公司；实时荧光定量PCR仪购自美国赛默飞公司；超灵敏化学发光成像仪购自上海天能仪器有限公司；流式细胞仪购自美国BD公司；倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.3 Western blot法检测Cx43、p-Cx43蛋白和MAPK信号转导通路相关蛋白的表达

收集各组H9c2细胞于1.5m L EP管中，离心，弃上清，PBS 洗3次，每管中加入含蛋白酶抑制剂的ＲIPA裂解液，离心取上液，BCA法测蛋白浓度，用裂解液调整蛋白浓度，加蛋白loading buffer加热进行变性，每孔上样10 μL。电泳，转膜，封闭，加入相应的一抗、二抗、ECL显色。采用Image Lab 3. 0 软件对免疫印迹图的灰度值分析。本实验重复3 次。

1.4 RT-PCR检测心肌细胞miR-206的表达

采用Trizol结合柱法提取细胞总RNA，采用miR-206特异性stem-loop逆转录引物和u6逆转录引物分别逆转录RNA，然后使用u6作为内参，SYBR Green方法相对定量分析miR-206的差异，实验结果采用2-ΔΔCT法分析。

1.5 统计学分析

此次实验的结果分析运用软件SPSS22.0，所得的数据按均数±标准差表示，运用单因素分析法来进行数据分析，当双侧检验P＜0.05可以证实差异具有统计学意义。

2. 结果

1. 一般性观察：造模后大鼠状态尚可，未出现感染等症状。假手术组大鼠全部存活，MIR组和MIR+antagomir组均存活7只大鼠，各死亡3只，MIR+miRNA-NC组存活6只，死亡4只。MIR各组大鼠出现大鼠毛蓬松、稀疏、干燥无光泽，活动力降低，呼吸频率加快，体重增长缓慢等表现，且上述表现随建模时间增长而愈加明显。
2. 病理切片HE染色及Masson染色结果分析：光学显微镜下观察HE染色显示：假手术组心肌细胞大小均匀，心肌纤维排列整齐，细胞核居中呈圆形或椭圆形；MIR组和MIR+antagomir组可见心肌细胞横径增大，有水肿、空泡现象，心肌纤维增粗，排列稍紊乱，但两组间无显著差异。镜下观察Masson染色切片显示：Sham组心肌细胞细胞核呈淡蓝色，胞质呈红色，结构正常，无明显水肿或变性，心肌纤维排列整齐，组织学表现正常，心肌细胞间有蓝色的胶原纤维，而MIR组和MIR+antagomir组可见心肌细胞排列紊乱，部分心肌细胞变性，心肌纤维溶解断裂，细胞间隙增宽，心肌细胞间可见胶原纤维沉积，且两组间之间无明显差异。
3. 左心室心肌RT-PCR结果分析：MIR组大鼠miR-206的相对表达水平量明显高于假手术组，差异具有统计学差异（P＜0.05）；antagomir输注干预后，MIR+antagomir组的miR-206相对表达水平均较MIR组明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05），但仍高于假手术组；而MIR+miRNA-NC组与MIR组比较无显著差异。见表1
4. 四组心肌细胞Cx43蛋白和MAPK信号转导通路相关蛋白的表达比较：

左心室心肌Cx43蛋白表达比较：与假手术组比较，MIR组大鼠左心室心肌Cx43蛋白表达量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与MIR组比较，MIR+antagomir组的左心室心肌Cx43蛋白表达量明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05），而MIR+miRNA-NC组与MIR组比较无显著差异。与假手术组比较，MIR组Cx43、pCx43蛋白表达均明显下调，两组间比较均有显著性差异（P<0.05或<0.01）。MIR组p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK、p-p38/p38、p-AKT/AKT等相关蛋白比值均较假手术组明显下降，而P65蛋白表达明显增加，两组间比较亦有显著性差异（P<0.05）。与MIR组比较，MIR+antagomir组的左心室心肌p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK、p-p38/p38、p-AKT/AKT等相关蛋白比值均明显增加，而P65蛋白表达明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05），而MIR+miRNA-NC组与MIR组比较无显著差异。见表1

表1 四组心肌细胞Cx43蛋白和MAPK信号转导通路相关蛋白的表达比较（x±s）

与正常对照组相比，a P＜0.05，b P＜0.01; 与MIR组相比，cP＜0.05, dP＜0.01

3 讨论

MIR导致的心肌损伤是一种严重的心血管事件，可并发心肌梗死、心律失常、休克或心力衰竭等严重心血管疾病，威胁生命安全，其病理表现主要是心肌水肿、坏死、心肌纤维化等。我们的结果显示，造模后可见MIR各组心肌细胞横径增大，有水肿、空泡现象，心肌纤维增粗，部分心肌细胞变性，心肌纤维溶解断裂，心肌细胞间可见胶原纤维沉积，这都符合MIR心肌细胞损伤的病理表现。

miR-206是目前研究最多的miRNAs之一，它通过作用于下游靶向基因参与多种信号通路调控生物合成的生物学过程。近年来研究还发现，miR-206作用于心肌细胞的损伤和凋亡，它的异常表达可能是心肌损伤中一种新的疾病生物标志物。Limana等[7]在慢性心衰的小鼠模型中注射HMGB1后发现，HMGB1通过增强心肌再生有效地延缓心衰过程中的心室重构, 并引起了miR-206的表达上调。还有研究结果显示，miR-206的上调和Cx43的下调可以引起心室重构, 最终导致扩张性心肌病[2]。我们的结果显示，MIR组miR-206表达较正常对照组增加，表明miR-206可能也参与了MIR的病理生理过程。

MIR的发生机制目前尚未明确，推测与心肌细胞的损伤凋亡等具有密切关系，而Cx43是心脏组织中表达最丰富的连接蛋白，参与调控心肌细胞的生长分化等生物学功能方面，与心血管疾病的发生发展密切相关[1]。既往研究通过敲除/敲入技术和药物治疗，证实Cx43在心脏MIR损伤中发挥重要作用，并具有保护作用[2]。最新的研究还显示，Cx43可能是miR-206的直接作用靶点[3]。成年小鼠的实验结果表明，miR-206能够抑制小鼠心房和心室肌中Cx43的表达，导致心电生理异常改变，缩短了实验小鼠的寿命[4]。我们的结果也显示，miR-206 mimics组与MIR组比较，在miR-206表达进一步增加的同时，Cx43、pCx43蛋白表达则减少（P<0.05），而阴性核苷酸组与MIR组比较却无显著差别（P>0.05）。结果表明，miR-206 可能通过调控MIR Cx43的表达参与MIR的心肌损伤。

MAPK是经典的信号传导通路，将信号从细胞表面传导到细胞核内部，主要包括ERK、JNK和P38三条经典途径，调节细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应等多种重要的细胞生理病理过程，在各种疾病的发生发展中具有重要作用。我们的结果进一步显示，MIR组p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK、p-p38/p38、p-AKT/AKT等MAPK信号传导通路相关蛋白比值均较正常对照组明显异常，两组间比较亦有显著性差异（P<0.05）。而miR-206 mimics组与MIR组比较，p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK、p-p38/p38、p-AKT/AKT等相关蛋白比值均增加。以上结果的比较表明，miR-206可能通过抑制MAPK多条信号转导途径参与MIR Cx43表达的调控。

以上结果可以推测，心肌细胞Cx43和经典MAPK信号通路蛋白都是miR-206下游的靶点，miR-206可能通过负调控MAPK信号通路中的相关蛋白而作用于Cx43，从而调控并减轻了心肌细胞在缺血再灌注后的损伤程度。这些结果为心肌缺血再灌注损伤治疗的的潜在靶点提供了可能的实验依据。

参考文献：

1. He M, Yang Z, Abdellatif M, et al. GTPase Activating Protein (Sh3 Domain) Binding Protein 1 Regulates the Processing of MicroRNA-1 during Cardiac Hypertrophy[J]. PLoS One, 2015; 10(12): e0145112.
2. Westendorp B, Major JL, Nader M, et al. The E2F6 repressor activates gene expression in myocardium resulting in dilated cardiomyopathy[J]. FASEB J, 2012; 26(6): 2569-2579.
3. Jin Y, Zhou TY, Cao JN, et al. MicroRNA-206 Downregulates Connexin43 in Cardiomyocytes to Induce Cardiac Arrhythmias in a Transgenic Mouse Model. Heart Lung Circ, 2018; pii: S1443-9506(18)31917-6.
4. Shan ZX, Lin QX, Fu YH, et al. Upregulated expression of miR-1/miR-206 in a rat model of myocardial infarction[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009; 381(4): 597-601.
5. Shan ZX, Lin QX, Deng CY, et al. miR-1/miR-206 regulate Hsp60 expression contributing to glucose-mediated apoptosis in cardiomyocytes[J]. FEBS Lett, 2010; 584(16): 3592-3600.
6. Limana F, Esposito G, D’Arcangelo D, et al. HMGB1 attenuates cardiac remodelling in the failing heart via enhanced cardiac regeneration and miR-206-mediated inhibition of TIMP-3[J]. PLo S One, 2011; 6(6): e19845.