构建CBFβ-MYH11基因突变的儿童AML（非M3型）患者风险预后模型

构建CBFβ-MYH11基因突变的儿童AML（非M3型）患者风险预后模型

肖祖刚 崔婷婷 李娜 宋春艳 杨春会

昆明医科大学附属儿童医院 昆明市儿童医院 云南 昆明 654000

摘要

【目的】

    儿童AML（非M3型）患者CBFβ-MYH11基因突变的风险预后模型深层次探讨CBFβ-MYH11基因突变对儿童AML（非M3型）患者的临床危险度分层及预后的影响。并对肿瘤免疫微环境进行分析，探索不同风险组之间的肿瘤免疫微环境的免疫细胞分布的差异。

【方法】

对TARGET数据库中儿童AML（非M3型）数据集进行数据清洗后，先后对CBFβ-MYH11基因突变和未突变组进行基因差异表达分析，富集分析寻找相关的生物学功能和通路，利用单因素分析方法、lasso分析、多因素Cox回归分析筛选出关键基因和构建风险预后模型，并使用ROC曲线评价模型的预后的能力。利用Cibersort算法评估了儿童AML患者的肿瘤微环境情况，并使用Pearson系数分析了关键基因与各免疫细胞的关系。

【结果】

通过生物信息学分析构建CBFβ-MYH11阳性的儿童AML患者突变的风险预后模型。同时通过分别对高低风险组的肿瘤免疫微环境分析发现，在高风险组中单核细胞和M2巨噬细胞的占比显著降低，而M0巨噬细胞和中性粒细胞占比则显著提高。

【结论】

成功构建CBFβ-MYH11阳性的儿童AML患者突变的风险预后模型。肿瘤免疫微环境分析研究发现高风险组中M0巨噬细胞和中性粒细胞占比则显著增高。

白血病是儿童最常见的恶性肿瘤，约占所有儿童恶性肿瘤的30%[1]。儿童主要以急性淋巴细胞白血病为主，急性髓系白血病在儿童白血病中约占15%-20%[2] 。儿童AML（非M3型）治疗效果不理想，易出现各种严重并发症，化疗后容易复发及髓外浸润等情况。并且经传统化疗后一旦出现复发，使用常规的化疗药物往往效果差，预后不良，多数需要行造血干细胞移植[3]。

CBFβ-MYH11突变广泛发生于AML患者中，CCLG-2019-AML指南中认为当t（16；16）和CBFβ-MYH11并存的患者可被定义为低危患者伴有c-KIT突变时则被定义为中危，同时近期的文章报道CBFβ-MYH11基因突变并不完全预示着预后良好，当合并某些基因突变（如NRAS,WT1等）时预后存在争议，为进一步探索CBFβ-MYH11与儿童AML(非M3型)预后的关系，我们基于TARGET数据库对CBFβ-MYH11基因突变进行了相关生物信息学分析[4]。

方法：

1基于CBFβ-MYH11基因突变的生物信息学分析结果

1.1数据清洗结果

经过对TARGET数据库中儿童AML（非M3型）数据集基因表达数据、临床信息数据、生存数据进行清洗后，共筛选出AML（非M3型）样本68个，其中40个野生型（widetype，WT）、28个突变型（mutant，MT）样本。

1.2肿瘤微环境分析

通过Cibersort分析了68例CBF-β阳性的儿童AML患者的高低风险组之间的肿瘤免疫微环境的情况，分析免疫细胞（包括单核细胞、M0巨噬细胞、M2巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞和M2巨噬细胞）的占比与高低风险组之间差异。

结果：

1.1差异基因的筛选结果

用|log2FC|>1，adj.p<0.05作为标准，共筛选获得儿童AML（非M3型）的MT样本与AML的WT样本间的差异表达基因共有4048个，其中在MT样本中表达上调的基因1716个，表达下调的基因2332个。并使用火山图进行展示（图1）。

图1 全部DEGs的差异表达情况的火山图

1.2富集分析结果

对这些差异表达基因进行功能富集分析，GO富集分析显示：细胞外结构组织（extracellular structure organization）、细胞外基质组织（extracellular matrix organization）、免疫球蛋白介导的免疫应答（immunoglobulin mediated immune response）、B细胞介导的免疫（B cell mediated immunity）、蛋白活化级联(protein activation cascade)、补体激活（complement activation）、循环免疫球蛋白介导的体液免疫应答（humoral immune response mediated by circulating immunoglobulin）、补体激活的经典途径（complement activation, classical pathway）、补体活化的调节(regulation of complement activation)、蛋白活化级联反应的调节(regulation of protein activation cascade)被显著富集，并是使用气泡图（图2）进行展示，纵坐标为富集的生物功能，横坐标GeneRatio为基因富集评分，越大说明越有意义，气泡大小与count值一致，越大说明富集结果越有意义。

图2  DEGs的GO富集分析

GSEA富集结果显示：肿瘤相关通路、Focal Adhesion通路、细胞外基质（ECM）受体互作通路（ECM-receptor interaction pathway）、TGFβ信号通路、T细胞受体信号通路、WNT信号通路被富集（图3）。

图3  GSEA富集分析

1.4预后模型的建立

基于生存信息文件，通过单因素Cox分析，从所有4048个DEGs中共筛选获得了434个与AML患者预后相关的基因（p<0.05）。对这些基因进行lasso分析和多因素Cox回归分析，最终确定了7个与预后密切相关的基因CLPSL2、FNDC9、COL3A1、SCARA3、HLF、MID2、DPEP1，然后再次进行单因素分析。使用森林图（图4）进行展示，第一列为基因名称，第二列为68个样本，第三列为各基因的危险度和其95%置信区间，最后一列为计算结果的p值。当各级基因危险度为1是表示无意义（即黑色方格与虚线重合），<1时为有利因素（即黑色方格在虚线左边），>1时为危险因素（即黑色方格在虚线右边）。

图4   7基因单因素分析的森林图

使用上述7个基因在lasso的多因素Cox分析中所得出的风险评分在计算风险切割曲线得最佳得cutoff，并构建预后模型。并按照风险评分中位值将68个样本划分为高低风险两组，并用KM生存曲线比较高低风险组得预后情况和组间差异，结果显示高风险组的存状态与生存时间明显差于低风险组（p<0.0001）(图5)。

图5  高低风险组的KM生存曲线

对所得预后模型就构建ROC曲线，结果显示预后模型的风险评分对患者生存的预测能力良好，对患者3年、4年、5年的生存预期的AUC值分别为0.83、0.85以及0.85（图5）。

图6   预后模型预后时间相关ROC曲线

比较MT和WT两组之间CLPSL2、FNDC9、COL3A1、SCARA3、HLF、MID2、DPEP1这7个基因表达水平的差异发现均具有显著的统计学差异。使用箱图（图7）进行展示，纵坐标为被归一化后的基因表达量水平，横坐标为基因名。

图7  在MT和WT组间预后关键基因表达量的比较

2.1肿瘤微环境分析结果

通过Cibersort分析了68例CBF-β阳性的儿童AML患者的高低风险组之间的肿瘤免疫微环境的情况，结果发现多种免疫细胞的占比高低风险组之间具有显著差异，包括单核细胞、M0巨噬细胞、M2巨噬细胞、中性粒细胞。单核细胞和M2巨噬细胞在高风险组AML患者样本中的占比显著降低，而M0巨噬细胞和中性粒细胞在高风险组患者样本中的占比则显著提高。 使用箱图（图8）进行展示，纵坐标为各免疫亚群细胞所占比例，横坐标为免疫亚群细胞。

图8  高低风险组之间的肿瘤免疫微环境比较

对上述在高低风险之间存在明显差异的4个免疫细胞亚群根据丰度的高低去构建KM生存曲线（图9），结果均具有显著差异，结果显示在单核细胞（p=0.0057）和M2巨噬细胞(p=0.0057)丰度高时预后更好，而M0巨噬细胞（p=0.0012）和中性粒细胞（p=0.0012）丰度更低时预后更好。纵坐标表示生存率，横坐标表示生存时间（年），high代表高丰度组，low代表低丰度组，淡红色和淡蓝色区域分别代表高低风险的KM生存曲线的95%置信区间。

图9   单核细胞、M0巨噬细胞、M2巨噬细胞、中性粒细胞高低丰度组之间的KM生存曲线

结论

1. 成功构建CBFβ-MYH11阳性的儿童AML患者突变的风险预后模型，能够有效评估该基因突变对儿童AML患者预后的影响。
2. 肿瘤免疫微环境分析研究发现单核细胞和M2巨噬细胞在高风险组中的占比显著降低，而M0巨噬细胞和中性粒细胞占比则显著提高，该发现对患儿预后的评估有一定理论参考价值。

讨论

CCAAT/增强子结合α蛋白（CEBPA）基因突变同样也是儿童AML（非M3型）常见基因突变之一，CEBPA突变可以是双等位基因突变也可以是单等位基因突变[5]。

一项研究对来自TARGET数据集的1803例确诊为AML的儿科患者根据CEBPA 状态分为两组进行评估。结果显示CEBPA突变发生率为18%。CEBPA突变与高龄(p < 0.001)、更高的WBC(p = 0.004)、更高比例的外周血原始细胞(p < 0.001)、正常核型(p < 0.001)、低风险(p < 0.001)和更高的完全缓解诱导率（p < 0.05）。与CEBPA野生型患者相比，CEBPA 突变患者具有更好的5年EFS（p < 0.001）和OS（p < 0.001），并且即使存在FLT3/ITD突变时EFS和OS也更好。多变量分析结果表明EFS(p = 0.007)和OS(p = 0.039)在CEBPA突变的患儿中具有更好的结果[6]。尽管有少数研究指出CEBPA为AML预后的不利因素，但在大多数的研究与我们的结果一样

[7]，都认为CEBPA突变对AML患儿预后有益。

参考文献：

[1]赵艳霞，孙立荣.儿童急性淋巴细胞白血病诊治进展[J].中国实用儿科杂志,2016.31(4):252-256.

[2] 汤静燕.儿童急性髓系白血病相关进展[J].中华临床医师杂志,2013,(5):1862-1865.

[3]周丽红,陈启文,黄正刚,钟楠.儿童急性髓系白血病138例临床分析[J].实用临床医学,2017,18(12):56-58.

[4] de Noronha TR, Mitne-Neto M, Chauffaille ML. Mutational profiling of acute myeloid leukemia with normal cytogenetics in Brazilian patients: the value of next-generation sequencing for genomic classification[J]. J Investig Med, 2017, 65(8): 1155-1158.

[5]Ahn S-Y, Kim T, Kim M, et al. Clinical Significance of bZIP in-Frame CEBPA-Mutated Normal Karyotype Acute Myeloid Leukemia[J]. Cancer Research and Treatment, 2023.

[7]Taskesen E, Bullinger L, Corbacioglu A, et al. Prognostic impact, concurrent genetic mutations, and gene expression features of AML with CEBPA mutations in a cohort of 1182 cytogenetically normal AML patients: further evidence for CEBPA double mutant AML as a distinctive disease entity[J]. Blood, 2011, 117(8): 2469–2475.