昆明医科大学附属儿童医院 昆明市儿童医院 云南 昆明 654000
摘要
【目的】
儿童AML(非M3型)患者CBFβ-MYH11基因突变的风险预后模型深层次探讨CBFβ-MYH11基因突变对儿童AML(非M3型)患者的临床危险度分层及预后的影响。并对肿瘤免疫微环境进行分析,探索不同风险组之间的肿瘤免疫微环境的免疫细胞分布的差异。
【方法】
对TARGET数据库中儿童AML(非M3型)数据集进行数据清洗后,先后对CBFβ-MYH11基因突变和未突变组进行基因差异表达分析,富集分析寻找相关的生物学功能和通路,利用单因素分析方法、lasso分析、多因素Cox回归分析筛选出关键基因和构建风险预后模型,并使用ROC曲线评价模型的预后的能力。利用Cibersort算法评估了儿童AML患者的肿瘤微环境情况,并使用Pearson系数分析了关键基因与各免疫细胞的关系。
【结果】
通过生物信息学分析构建CBFβ-MYH11阳性的儿童AML患者突变的风险预后模型。同时通过分别对高低风险组的肿瘤免疫微环境分析发现,在高风险组中单核细胞和M2巨噬细胞的占比显著降低,而M0巨噬细胞和中性粒细胞占比则显著提高。
【结论】
成功构建CBFβ-MYH11阳性的儿童AML患者突变的风险预后模型。肿瘤免疫微环境分析研究发现高风险组中M0巨噬细胞和中性粒细胞占比则显著增高。
白血病是儿童最常见的恶性肿瘤,约占所有儿童恶性肿瘤的30%[1]。儿童主要以急性淋巴细胞白血病为主,急性髓系白血病在儿童白血病中约占15%-20%[2] 。儿童AML(非M3型)治疗效果不理想,易出现各种严重并发症,化疗后容易复发及髓外浸润等情况。并且经传统化疗后一旦出现复发,使用常规的化疗药物往往效果差,预后不良,多数需要行造血干细胞移植[3]。
CBFβ-MYH11突变广泛发生于AML患者中,CCLG-2019-AML指南中认为当t(16;16)和CBFβ-MYH11并存的患者可被定义为低危患者伴有c-KIT突变时则被定义为中危,同时近期的文章报道CBFβ-MYH11基因突变并不完全预示着预后良好,当合并某些基因突变(如NRAS,WT1等)时预后存在争议,为进一步探索CBFβ-MYH11与儿童AML(非M3型)预后的关系,我们基于TARGET数据库对CBFβ-MYH11基因突变进行了相关生物信息学分析[4]。
方法:
1基于CBFβ-MYH11基因突变的生物信息学分析结果
1.1数据清洗结果
经过对TARGET数据库中儿童AML(非M3型)数据集基因表达数据、临床信息数据、生存数据进行清洗后,共筛选出AML(非M3型)样本68个,其中40个野生型(widetype,WT)、28个突变型(mutant,MT)样本。
1.2肿瘤微环境分析
通过Cibersort分析了68例CBF-β阳性的儿童AML患者的高低风险组之间的肿瘤免疫微环境的情况,分析免疫细胞(包括单核细胞、M0巨噬细胞、M2巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞和M2巨噬细胞)的占比与高低风险组之间差异。
结果:
1.1差异基因的筛选结果
用|log2FC|>1,adj.p<0.05作为标准,共筛选获得儿童AML(非M3型)的MT样本与AML的WT样本间的差异表达基因共有4048个,其中在MT样本中表达上调的基因1716个,表达下调的基因2332个。并使用火山图进行展示(图1)。
图1 全部DEGs的差异表达情况的火山图
1.2富集分析结果
对这些差异表达基因进行功能富集分析,GO富集分析显示:细胞外结构组织(extracellular structure organization)、细胞外基质组织(extracellular matrix organization)、免疫球蛋白介导的免疫应答(immunoglobulin mediated immune response)、B细胞介导的免疫(B cell mediated immunity)、蛋白活化级联(protein activation cascade)、补体激活(complement activation)、循环免疫球蛋白介导的体液免疫应答(humoral immune response mediated by circulating immunoglobulin)、补体激活的经典途径(complement activation, classical pathway)、补体活化的调节(regulation of complement activation)、蛋白活化级联反应的调节(regulation of protein activation cascade)被显著富集,并是使用气泡图(图2)进行展示,纵坐标为富集的生物功能,横坐标GeneRatio为基因富集评分,越大说明越有意义,气泡大小与count值一致,越大说明富集结果越有意义。
图2 DEGs的GO富集分析
GSEA富集结果显示:肿瘤相关通路、Focal Adhesion通路、细胞外基质(ECM)受体互作通路(ECM-receptor interaction pathway)、TGFβ信号通路、T细胞受体信号通路、WNT信号通路被富集(图3)。
图3 GSEA富集分析
1.4预后模型的建立
基于生存信息文件,通过单因素Cox分析,从所有4048个DEGs中共筛选获得了434个与AML患者预后相关的基因(p<0.05)。对这些基因进行lasso分析和多因素Cox回归分析,最终确定了7个与预后密切相关的基因CLPSL2、FNDC9、COL3A1、SCARA3、HLF、MID2、DPEP1,然后再次进行单因素分析。使用森林图(图4)进行展示,第一列为基因名称,第二列为68个样本,第三列为各基因的危险度和其95%置信区间,最后一列为计算结果的p值。当各级基因危险度为1是表示无意义(即黑色方格与虚线重合),<1时为有利因素(即黑色方格在虚线左边),>1时为危险因素(即黑色方格在虚线右边)。
图4 7基因单因素分析的森林图
使用上述7个基因在lasso的多因素Cox分析中所得出的风险评分在计算风险切割曲线得最佳得cutoff,并构建预后模型。并按照风险评分中位值将68个样本划分为高低风险两组,并用KM生存曲线比较高低风险组得预后情况和组间差异,结果显示高风险组的存状态与生存时间明显差于低风险组(p<0.0001)(图5)。
图5 高低风险组的KM生存曲线
对所得预后模型就构建ROC曲线,结果显示预后模型的风险评分对患者生存的预测能力良好,对患者3年、4年、5年的生存预期的AUC值分别为0.83、0.85以及0.85(图5)。
图6 预后模型预后时间相关ROC曲线
比较MT和WT两组之间CLPSL2、FNDC9、COL3A1、SCARA3、HLF、MID2、DPEP1这7个基因表达水平的差异发现均具有显著的统计学差异。使用箱图(图7)进行展示,纵坐标为被归一化后的基因表达量水平,横坐标为基因名。
图7 在MT和WT组间预后关键基因表达量的比较
2.1肿瘤微环境分析结果
通过Cibersort分析了68例CBF-β阳性的儿童AML患者的高低风险组之间的肿瘤免疫微环境的情况,结果发现多种免疫细胞的占比高低风险组之间具有显著差异,包括单核细胞、M0巨噬细胞、M2巨噬细胞、中性粒细胞。单核细胞和M2巨噬细胞在高风险组AML患者样本中的占比显著降低,而M0巨噬细胞和中性粒细胞在高风险组患者样本中的占比则显著提高。 使用箱图(图8)进行展示,纵坐标为各免疫亚群细胞所占比例,横坐标为免疫亚群细胞。
图8 高低风险组之间的肿瘤免疫微环境比较
对上述在高低风险之间存在明显差异的4个免疫细胞亚群根据丰度的高低去构建KM生存曲线(图9),结果均具有显著差异,结果显示在单核细胞(p=0.0057)和M2巨噬细胞(p=0.0057)丰度高时预后更好,而M0巨噬细胞(p=0.0012)和中性粒细胞(p=0.0012)丰度更低时预后更好。纵坐标表示生存率,横坐标表示生存时间(年),high代表高丰度组,low代表低丰度组,淡红色和淡蓝色区域分别代表高低风险的KM生存曲线的95%置信区间。
图9 单核细胞、M0巨噬细胞、M2巨噬细胞、中性粒细胞高低丰度组之间的KM生存曲线
结论
讨论
CCAAT/增强子结合α蛋白(CEBPA)基因突变同样也是儿童AML(非M3型)常见基因突变之一,CEBPA突变可以是双等位基因突变也可以是单等位基因突变[5]。
一项研究对来自TARGET数据集的1803例确诊为AML的儿科患者根据CEBPA 状态分为两组进行评估。结果显示CEBPA突变发生率为18%。CEBPA突变与高龄(p < 0.001)、更高的WBC(p = 0.004)、更高比例的外周血原始细胞(p < 0.001)、正常核型(p < 0.001)、低风险(p < 0.001)和更高的完全缓解诱导率(p < 0.05)。与CEBPA野生型患者相比,CEBPA 突变患者具有更好的5年EFS(p < 0.001)和OS(p < 0.001),并且即使存在FLT3/ITD突变时EFS和OS也更好。多变量分析结果表明EFS(p = 0.007)和OS(p = 0.039)在CEBPA突变的患儿中具有更好的结果[6]。尽管有少数研究指出CEBPA为AML预后的不利因素,但在大多数的研究与我们的结果一样
[7],都认为CEBPA突变对AML患儿预后有益。
参考文献:
[1]赵艳霞,孙立荣.儿童急性淋巴细胞白血病诊治进展[J].中国实用儿科杂志,2016.31(4):252-256.
[2] 汤静燕.儿童急性髓系白血病相关进展[J].中华临床医师杂志,2013,(5):1862-1865.
[3]周丽红,陈启文,黄正刚,钟楠.儿童急性髓系白血病138例临床分析[J].实用临床医学,2017,18(12):56-58.
[4] de Noronha TR, Mitne-Neto M, Chauffaille ML. Mutational profiling of acute myeloid leukemia with normal cytogenetics in Brazilian patients: the value of next-generation sequencing for genomic classification[J]. J Investig Med, 2017, 65(8): 1155-1158.
[5]Ahn S-Y, Kim T, Kim M, et al. Clinical Significance of bZIP in-Frame CEBPA-Mutated Normal Karyotype Acute Myeloid Leukemia[J]. Cancer Research and Treatment, 2023.
[7]Taskesen E, Bullinger L, Corbacioglu A, et al. Prognostic impact, concurrent genetic mutations, and gene expression features of AML with CEBPA mutations in a cohort of 1182 cytogenetically normal AML patients: further evidence for CEBPA double mutant AML as a distinctive disease entity[J]. Blood, 2011, 117(8): 2469–2475.