简介:摘要目的探讨严重烧伤患者休克期肝素结合蛋白(HBP)的变化及其在体外对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)和中性粒细胞的影响。方法采用前瞻性观察性研究与实验研究方法。将2020年8—11月南京医科大学附属苏州医院烧伤整形科收治的符合入选标准的20例严重烧伤患者纳入严重烧伤组[男12例、女8例,年龄为44.5(31.0,58.0)岁],同期招募该单位体检中心体检结果正常的20名健康志愿者纳入健康对照组[男13例、女7例,年龄为39.5(26.0,53.0)岁]。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测健康对照组志愿者血浆与严重烧伤组患者伤后48 h内血浆中HBP和组织金属蛋白酶抑制物1(TIMP-1)蛋白表达水平,分别对2组血浆中HBP和TIMP-1蛋白表达的相关性进行Pearson相关分析。取第4代对数生长期HUVEC进行实验,将细胞按随机数字表法(分组方法下同)分为常规培养的正常对照组(处理下同)与进行相应处理的重组HBP(rHBP)处理12 h组、rHBP处理24 h组、rHBP处理48 h组,采用实时荧光定量反转录PCR法检测细胞中TIMP-1的mRNA表达;将细胞分为正常对照组与进行相应处理的rHBP处理48 h组,采用蛋白质印迹法检测细胞中TIMP-1蛋白表达;将细胞分为正常对照组与加入相应试剂处理的单纯rHBP组、单纯抑蛋白酶多肽组、rHBP+抑蛋白酶多肽组(rHBP终物质的量浓度为200 nmol/L,抑蛋白酶多肽终质量浓度为20 μg/mL),培养48 h,采用ELISA法检测细胞培养上清液中TIMP-1蛋白表达水平。采用免疫磁珠分选法从前述10名健康志愿者外周静脉血中分离中性粒细胞,将细胞分为正常对照组与加入相应试剂处理的单纯重组TIMP-1(rTIMP-1)组、单纯佛波酯组、rTIMP-1+佛波酯组(rTIMP-1终质量浓度为500 ng/mL,佛波酯终物质的量浓度为10 nmol/L),培养1 h,采用免疫荧光法观测细胞中CD63蛋白表达,采用流式细胞术检测细胞中CD63蛋白阳性表达率,采用ELISA法检测细胞培养上清液中HBP和髓过氧化物酶(MPO)蛋白表达水平。正常对照组均于适宜时间点进行前述相关检测,细胞实验中各组样本数均为3。对数据行χ2检验、Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis H检验、Tamhane T2检验。结果严重烧伤组患者血浆中HBP、TIMP-1蛋白表达水平分别为404.9(283.1,653.2)、262.1(240.6,317.4)ng/mL,均明显高于健康对照组志愿者的61.6(45.0,68.9)、81.0(66.3,90.0)ng/mL(Z值分别为-5.41、-5.21,P<0.01)。健康对照组志愿者血浆中HBP和TIMP-1蛋白表达相关性不强(P>0.05),严重烧伤组患者血浆中HBP和TIMP-1蛋白表达呈明显正相关(r=0.64,P<0.01)。与正常对照组比较,rHBP处理12 h组、rHBP处理24 h组、rHBP处理48 h组HUVEC中TIMP-1 mRNA表达水平均显著升高(t值分别为-3.58、-2.25、-1.26,P<0.05)。蛋白质印迹法检测显示,与正常对照组比较,rHBP处理48 h组HUVEC中TIMP-1蛋白表达明显增强。培养48 h,与正常对照组比较,单纯rHBP组HUVEC培养上清液中TIMP-1蛋白表达水平显著升高(t=9.43,P<0.05),单纯抑蛋白酶多肽组、rHBP+抑蛋白酶多肽组HUVEC培养上清液中TIMP-1蛋白表达水平均无明显变化(P>0.05);与单纯rHBP组比较,rHBP+抑蛋白酶多肽组HUVEC培养上清液中TIMP-1蛋白表达水平显著下降(t=4.76,P<0.01)。培养1 h,免疫荧光法和流式细胞术检测的各组中性粒细胞CD63蛋白表达结果趋势一致。培养1 h,与正常对照组比较,单纯rTIMP-1组中性粒细胞中CD63蛋白阳性表达率及细胞培养上清液中HBP、MPO蛋白表达水平均无明显变化(P>0.05),单纯佛波酯组、rTIMP-1+佛波酯组中性粒细胞中CD63蛋白阳性表达率及细胞培养上清液中HBP、MPO蛋白表达水平均明显升高(t值分别为2.41、3.82,5.73、1.05、4.16、1.08,P<0.05或P<0.01);与单纯佛波酯组比较,rTIMP-1+佛波酯组中性粒细胞中CD63蛋白阳性表达率及细胞培养上清液中HBP、MPO蛋白表达水平均明显下降(t值分别为5.26、2.83、1.26,P<0.05或P<0.01)。结论严重烧伤患者休克期血浆中HBP表达水平增加;HBP可在体外诱导HUVEC分泌TIMP-1,TIMP-1可降低人中性粒细胞CD63分子表达。
简介:摘要目的探讨肝素结合蛋白(HBP)对烧伤早期血管通透性改变的影响。方法①临床研究:采集2019年1月1日至8月30日南京医科大学附属苏州医院收治的12例重度烧伤患者入院0.5 h内全血标本,检测白细胞计数(WBC)、中性粒细胞绝对值和比例以及血清HBP水平;以同期8例严重创伤患者作为对照,以明确重度烧伤患者炎性指标及HBP与其他严重创伤患者的差异。留取12例重度烧伤患者入院9 d内血清标本,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测多糖包被代谢产物黏结合蛋白多糖-1(syndecan-1)和透明质酸(HA)水平。采用线性相关法分析HBP与中性粒细胞比例、syndecan-1和HA的相关性。②基础研究:制备6~8周龄SD大鼠30%总体表面积(TBSA)Ⅲ度烧伤模型,低分子肝素(LMWN)干预组(n=5)大鼠于伤后即刻经腹部皮下注射200 U/kg低分子肝素钠(2 h 1次,共4次);烧伤组(n=5)给予等量生理盐水;正常对照组(n=5)不给予任何干预。分别于伤后0、2、4、8 h取大鼠外周静脉血检测血清HBP、syndecan-1和HA水平,取大鼠肺组织于透射电镜下观察肺血管内皮细胞多糖包被损伤情况。结果①临床研究结果:12例重度烧伤患者与8例严重创伤患者WBC、中性粒细胞绝对值和比例以及HBP水平均升高,两组WBC、中性粒细胞绝对值和比例差异无统计学意义〔WBC(×109/L):14.5±6.1比10.8±3.6,中性粒细胞绝对值(×109/L):12.0±5.9比9.0±4.0,中性粒细胞比例:0.81±0.10比0.79±0.14,均P>0.05〕;但烧伤患者HBP水平明显高于创伤患者(μg/L:192.92±61.73比51.17±23.05,P<0.01)。12例重度烧伤患者伤后血清syndecan-1和HA水平急剧升高,并呈持续升高趋势,9 d达峰值〔syndecan-1(μg/L):16.02±0.39,HA(μg/L):106.83±4.90〕。相关分析显示,重度烧伤患者入院1 d血清HBP与中性粒细胞比例、syndecan-1和HA均呈显著正相关(r值分别为0.805、0.732、0.900,均P<0.01)。说明烧伤引起中性粒细胞急剧升高后释放大量HBP,同时血管内皮多糖包被受到严重破坏。②基础研究结果:烧伤组大鼠伤后血清HBP、syndecan-1和HA水平均较正常对照组急剧升高,并随时间延长呈持续升高趋势,伤后8 h达峰值;LMWH干预组血清HBP、syndecan-1和HA水平均较烧伤组明显降低,8 h时差异仍有统计学意义〔HBP(μg/L):6.47±0.25比12.48±0.08,syndecan-1(μg/L):19.06±1.48比25.92±3.34,HA(μg/L):35.76±2.10比54.91±2.64,均P<0.01〕。透射电镜下显示大鼠肺血管多糖包被结构:正常对照组结构连续、分布均匀、致密;烧伤组2 h时结构即明显破坏、脱落,8 h时已基本观察不到多糖包被结构;LMWH干预组结构破坏、脱落现象明显减轻,8 h时仍能观察到多糖包被结构。结论严重烧伤患者早期血管通透性增加,体液大量丢失,与烧伤早期中性粒细胞急剧升高并释放高水平HBP造成内皮细胞多糖包被破坏有关。
简介:摘要目的观察严重烧伤患者早期外周血中性粒细胞趋化功能变化及影响因素。方法将2019年1—5月南京医科大学附属苏州医院收治的符合入选标准的7例伤后6 h内入院的严重烧伤患者纳入烧伤组[男4例、女3例,年龄(36±10)岁],同期招募该单位体检中心体检结果正常的7名健康志愿者纳入健康对照组[男5名、女2名,年龄为(35±8)岁],进行前瞻性对照研究。(1)烧伤组患者于入院后1、3、5 d各抽取2 mL静脉血,健康对照组志愿者取2 mL静脉血,常规检测白细胞计数、血小板计数、中性粒细胞计数及血清降钙素原、C反应蛋白水平。(2)同前取烧伤患者和健康志愿者静脉血,酶联免疫吸附测定法检测白细胞介素6(IL-6)、IL-10、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。(3)同前取烧伤患者和健康志愿者静脉血,Ficoll密度梯度离心法分离外周血中性粒细胞,琼脂糖趋化实验检测细胞趋化距离,流式细胞仪仅检测烧伤组患者入院后3 d及健康对照组志愿者趋化因子受体CXCR1、CXCR2阳性表达率。对数据行重复测量方差分析、t检验及Bonferroni校正。结果(1)烧伤组患者入院后1、3、5 d血小板计数与健康对照组志愿者相近(t=0.55、0.44、0.12,P>0.05)。烧伤组患者入院后1、3、5 d中性粒细胞计数、白细胞计数及血清降钙素原、C反应蛋白表达水平均明显高于健康对照组志愿者(t=196.96、273.31、45.22,3.46、4.18、5.55,4.36、5.26、11.13,64.94、89.97、84.31, P<0.01)。(2)烧伤组患者入院后1、3、5 d IL-6水平明显高于健康对照组志愿者(t=187.43、213.54、195.74,P<0.01),IL-10水平明显高于健康对照组志愿者(t=21.47、11.13、6.23,P<0.01),TNF-α水平明显高于健康对照组志愿者(t=5.27、7.89、15.58,P<0.01)。(3)烧伤组患者入院后1、3、5 d中性粒细胞趋化距离分别为(1 479±102)、(1 395±82)、(1 017±91)μm,明显短于健康对照组志愿者的(1 902±120)μm,t=7.11、9.23、15.55,P<0.01。(4)烧伤组患者入院后3 d中性粒细胞CXCR1、CXCR2阳性表达率分别为(48.3±1.6)%、(79.0±1.8)%,明显低于健康对照组志愿者的(95.4±4.5)%、(97.8±2.1)%,t=27.13、23.10,P<0.01。结论严重烧伤患者早期外周血中性粒细胞趋化功能障碍,这可能与CXCR1、CXCR2降低有关。