简介：目的：拼接DNA片段并克隆。方法：用T4DNA连接酶将DNA片段以平末端随机连接,随后用限制性内切酶切割,琼脂糖电泳分离酶切产物,挑选特定片段纯化回收,与线性化的载体质粒连接,转化大肠杆菌感受态细胞。结果：通过以上步骤,成功拼接了不同DNA片段,构建了含有目的拼接片段的重组质粒。结论：该方法简便、易行、可靠,可作为拼接、克隆DNA的备选方案,在分子生物学研究和基因工程中应用。

简介：我们知道，对蛋白质在细胞中的特异定位，可以增进我们对该蛋白质以及与该蛋白互作的其他蛋白功能的了解，确定蛋白质位置的一个方法是。在其上加一特异抗体。即对其贴上标签，然后加入能同此抗体特异结合的探针，最后用显微镜确定此探针在细胞中的位置。

简介：分泌途径主要由内膜系统构成,内质网和高尔基体对于分泌蛋白的运输及定位具有重要作用.分泌蛋白的运输包括顺行途径和逆行途径.蛋白质通过质流和受体介导的途径运输到小泡中.在植物中,分泌蛋白的运输主要通过小泡和相连的小管来完成.分子伴侣和质量控制不仅能优化新合成蛋白的折叠和组装,而且去除了有折叠缺陷的蛋白.分泌蛋白的定位需要特定的信号肽,而高尔基体固有蛋白以依赖跨膜长度的方式,沿着分泌途径的细胞器分布.本文对植物表达分泌蛋白的分泌途径及定位、相关的分子伴侣和质量控制进行了综述.

简介：目的：研究植物细胞响应机械应力的形态学变化；初步探讨壁膜连接对于植物细胞响应机械应力的意义，及其是否参与机械应力响应过程。方法：将植物单细胞包埋后进行精确机械力加载并培养数日，每天抽样进行显微观测和图像分析监测其形态变化；在此基础上进行质壁分离，并采用RGD多肽处理中断细胞壁膜连接后进行应力加载，监测其形态变化。结果：植物细胞经机械应力加载后，其分裂方向趋于垂直应力加载方向。经壁膜连接中断处理后进行加载的植物细胞失去沿主应力线垂直方向分裂的能力，细胞分裂方向呈无序状态。结论：壁膜连接特别是以RGD序列识别为基础的细胞连接参与了植物细胞对机械应力的响应过程。

简介：目的：克隆并表达caspase-8／10相关RING结构域蛋白1（CARP1）基因，检测其泛素连接酶活性。方法：提取结肠癌HCT116细胞总RNA，RT-PCR扩增CARP1基因，将其克隆到真核表达载体pcDNA3-Flag中，序列正确的阳性克隆进行扩增，提取质粒转染至293T细胞中进行瞬时表达，通过体内泛素化检测其泛素化酶活性，通过萤光素酶报告基因的方法检测其对NF-kB转录活性的影响，利用细胞生长曲线检测CARP1基因对结肠癌细胞生长的影响。结果：免疫印迹实验表明CARP1基因在293T细胞中获得有效表达；免疫共沉淀实验表明，当CARP1存在时，受体相互作用蛋白1（RIP1）被泛素化；萤光素酶实验结果表明CARP1抑制肿瘤坏死因子a（TNFa）引起的NF-kB报道基因的激活；通过生长曲线发现CARP1能促进结肠癌细胞系HCT116生长，并能部分抵抗顺铂抑制细胞生长的作用。结论：构建的人CARP1基因真核表达载体在293T细胞中获得表达，表达产物具有RIP1泛素连接酶的活性，可抑制TNFa引起的NF-kB报告基因的激活，并且促进结肠癌细胞的生长，为进一步的基因功能研究奠定了基础。

简介：人类改造自然的想象力和创造力是无与伦比的。1985年,Lovell-Badge首次提出利用转基因动物乳腺生产重组蛋白质,数年间这一几近天方夜谭的神话已梦想成真。在研究小鼠模型基础上,1990年春,5只生产人α-抗胰蛋白酶的转基因羊在英国诞生,乳中蛋白质的表达水平已达30g/L,迄今已稳定遗传三代,现已进入临床实验。同年荷兰诞生了第一头生产人乳铁蛋白的转基因牛,现已繁殖20多头。对于这些产奶量

简介：为了明确pten敲除小鼠中转录上调基因pdd87编码蛋白在细胞中的定位,构建PDD87与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白表达载体pEGFP-C1-pdd87,利用Lipofectamine2000转染该载体于体外培养的NIH3T3细胞中,采用高尔基体特异探针BODIPYTRC5-Ceramide染色显示高尔基体,激光共聚焦显微镜下观察到PDD87-GFP融合蛋白定位于高尔基体,提示pdd87基因编码的蛋白定位于高尔基体.

简介：人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是一种用于治疗血栓性心血管疾病的特效药物,它能激活血纤维蛋白酶原,后者使血块溶解,所以这种药物的开发为社会普遍重视。t-PA在人体血液中的含量极低,很难从天然材料中提取。如果应用转基因技术,将人t-PA基因转入动物体内,使其在乳腺中高效表达,从乳汁中提取大量的t-PA,将具有可观的经济效益和社会效益。转基因动物建立的前提条件是构建乳腺定位高效表达载体。为此,我们先将本所保存的t-