简介:目的:构建能介导结缔组织生长因子(CTGF)基因RNA干扰的复制缺陷型腺病毒表达载体。方法:以大鼠CTGF基因为靶序列,设计并合成含编码短发夹RNA序列的寡核苷酸,构建腺病毒穿梭质粒P-shuttle-CTGF,酶切及测序分析正确后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染AD-293细胞,进行病毒包装,得到腺病毒载体Ad.H1-CTGF,用该载体感染HSC-T6细胞,观察其对CTGF基因表达抑制的效果。结果:构建的腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF经酶切、测序分析证实正确;包装的病毒载体滴度为4×1010PFU/mL,感染HSC-T6细胞后,Western印迹证实CTGF表达显著减少。结论:构建的腺病毒载体Ad.H1-CTGF可有效抑制HSC-T6中CTGF的表达,为抗纤维化研究提供了有力的工具。
简介:目的:构建GFE-1多吠与重组人肿瘤坏死因子d(rmhTNF一仅)融合蛋白(GFE-1-rmhTNF),研究该融合蛋白的体外活性和体内分布。方法:利用基因工程方法,将人工合成的编码GFE—l的寡核苷酸片段连接在rmhTNF—d序列的3’端,转入大肠杆菌中诱导表达,采用Q—SepharoseFF阴离子层析柱和SP—SepharoseFF阳离子层析柱纯化蛋白,SDS—PAGE和Western印迹鉴定,测定该融合蛋白的体外活性,观察其在小鼠体内的分布情况。结果:构建了融合蛋白GFE-1-rmhTNF,并在大肠杆菌中获得高效表达。体外活性实验显示,GFE-1-rⅢhTNF对L929细胞有明显的杀伤活性;体内分布实验证实,GFE-I-rmhTNF在小鼠肺组织的富集远高于肝肾组织。结论:构建了融合蛋白GFE-1-rmhTNF.,可显著杀伤L929细胞并特异性富集于小鼠肺组织。