简介:摘要目的探讨自噬是否参与屋尘螨(HDM)诱导的哮喘气道重塑,评估自噬抑制剂氯喹(CQ)在小鼠哮喘模型中的临床疗效。方法用转化生长因子-β(TGF-β)单独或联合自噬抑制剂CQ共同体外培养人支气管上皮细胞,蛋白质印迹法(Western blot)检测气道重塑相关蛋白胶原蛋白Ⅰ(Collagen-Ⅰ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及自噬相关蛋白(LC3-Ⅰ/Ⅱ)表达。2、用6~8周龄的BALB/c小鼠建立HDM诱导过敏性哮喘动物模型,正常对照组用生理盐水替代;HDM+CQ组小鼠在HDM激发第4周开始同时给与CQ(50 mg/kg)鼻内注射2周,收集支气管肺泡灌洗液,进行嗜酸性粒细胞,中性粒细胞分析计数,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测TGF-β、白细胞介素(IL)-4、IL-5含量,采用两样本t检验、单因素方差分析统计数据。结果TGF-β可增强人支气管上皮细胞Collagen-Ⅰ、α-SMA及自噬标志物LC3-Ⅰ/Ⅱ的表达,加用自噬抑制剂CQ后Collagen-Ⅰ、α-SMA表达均被到抑制HDM+CQ组嗜酸细胞数低于HDM组[(1.36±0.17)×105比(2.54±0.13)×105,t=13.275,P<0.01];HDM+CQ组中性粒细胞数低于HDM组[(0.45±0.06)×105比(0.59±0.08)×105,t=72.582,P<0.05];HDM组TGF-β高于对照组[(16.82±1.35) ng/ml比(5.90±1.03) ng/ml,t=11.234,P<0.01];HDM+CQ组TGF-β低于HDM组[(13.13±1.98) ng/ml比(16.82±1.35) ng/ml,t=17.035,P<0.05];HDM+CQ组IL-4低于HDM组[(52.75±5.12) pg/ml比(61.13±4.57) pg/ml,t=10.790,P<0.05]。Western blot检测肺组织匀浆中Collagen-Ⅰ、α-SMA及LC3-Ⅰ/Ⅱ的表达:HDM组Collagen-Ⅰ、α-SMA及LC3-Ⅱ的表达较对照组均明显增强,给与自噬抑制剂CQ后Collagen-Ⅰ、α-SMA的表达明显减弱。结论自噬参与了过敏性哮喘的气道重塑,自噬抑制剂可减轻哮喘模型小鼠中气道炎性细胞的聚集及气道重塑因子的生成。
简介:摘要目的探讨烟曲霉对小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)自噬流的影响。方法灭活烟曲霉体外诱导小鼠BMDM不同时间(0、0.5、4、12 h),提取细胞蛋白,Western印迹法检测自噬关键蛋白LC3-Ⅰ型/Ⅱ型的转换及磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)Ser2481的蛋白水平。用烟曲霉和溶酶体阻断剂[包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64d+胃蛋白酶抑制剂pepstatin、巴佛洛霉素-A1(BAF-A1)、氯化铵、氯喹]单独或联合体外诱导小鼠BMDM不同时间(4、12 h)后,Western印迹法检测烟曲霉对新生的LC3-Ⅱ、细胞基础自噬流的影响,并通过共聚焦荧光显微镜观察烟曲霉与LC3、Rubicon(RUN domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich-domain-containing protein)的共定位关系。不同处理时间数据结果采用非匹配t检验分析,烟曲霉孢子和自噬溶酶体阻断剂两因素处理数据结果采用2 × 2析因分析方法。结果Western印迹显示,与对照组(0 h组)比较,烟曲霉体外诱导小鼠BMDM 0.5、4、12 h后细胞内LC3-Ⅱ表达逐渐增加,差异均有统计学意义(t值分别为6.58、3.28、3.02,均P < 0.05),但各组p-mTOR蛋白水平差异无统计学意义(t值分别为0.441、0.477、0.382,P值分别为0.682、0.660、0.722)。与单独氯喹处理BMDM 4 h和12 h相比,烟曲霉联合氯喹处理后LC3-Ⅱ进一步增高,差异均有统计学意义(t = 2.13、2.78,均P < 0.05)。与单独氯化铵处理BMDM 4 h和12 h相比,烟曲霉联合氯化铵处理后LC3-Ⅱ进一步增高,差异均有统计学意义(t = 2.92、2.92,均P < 0.05)。与单独BAF-A1处理BMDM 4 h和12 h相比,烟曲霉联合BAF-A1处理后LC3-Ⅱ进一步增高,差异有统计学意义(t = 2.13、2.13,均P < 0.05)。与单独E-64d + pepstatin处理BMDM 4 h和12 h相比,烟曲霉联合E-64d + pepstatin处理后LC3-Ⅱ进一步增高,差异有统计学意义(t = 2.13、2.92,均P < 0.05)。用钙荧光白荧光标记的烟曲霉孢子刺激BMDM 8 h后,共聚焦荧光显微镜显示LC3、Rubicon主要包绕于烟曲霉周围,与烟曲霉均有共定位关系。结论烟曲霉体外诱导可增加小鼠BMDM基础自噬流。
简介:摘要目的探讨脂多糖(LPS)刺激下NUFIP-1介导核糖体自噬在树突细胞(DCs)凋亡中的作用及意义。方法将培养的树突细胞系DC2.4分为空白对照组及LPS刺激6、12、24、48、72 h组(n=5),LPS各亚组加入1 μg/mL LPS培养相应时间。采用Western blot检测各组细胞NUFIP-1及自噬相关蛋白p62和LC3B表达水平,激光共聚焦显微镜检测NUFIP-1在细胞中的表达与定位及其分别与Lyso-tracker、LC3B共定位情况。将载有沉默空载体NS及沉默慢病毒载体NUFIP-1 siRNA感染DC2.4 (n=3),以1 μg/mL LPS刺激24 h,应用流式细胞分析术检测细胞凋亡情况,并采用Western blot检测凋亡相关蛋白包括胱天蛋白酶(cleaved-caspase-3)和Bcl-2表达水平。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),采用LSD-t法进一步进行组间两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。结果Western blot结果提示,LPS刺激不同时间(6、12、24、48、72 h)后DC2.4中NUFIP-1蛋白表达水平呈现先升高后下降趋势,其中LPS 24 h组NUFIP-1表达水平显著高于空白对照组[空白对照组:(0.6786 ± 0.0820);LPS 24 h组:(1.4830 ± 0.1170),P<0.01]。同时,LPS 24 h组p62表达水平显著低于空白对照组[空白对照组:(0.9087 ± 0.1235);LPS 24 h组:(0.3113 ± 0.5571),P<0.01]。LPS 24 h组LC3B-I向LC3B-Ⅱ的转化显著高于空白对照组[空白对照组:(0.5542 ± 0.1248);LPS 24 h组:(2.5310 ± 0.3119),P<0.01]。激光共聚焦显微镜观察显示,NUFIP-1主要定位于细胞核及核周,LPS刺激后其荧光强度于6 h至24 h呈时间依赖性增强,而刺激48、72 h明显减弱。同时,NUFIP-1与Lyso-tracker及LC3B的共定位较空白对照组显著增强。采用慢病毒感染技术感染NUFIP-1 siRNA可显著下调DC2.4 NUFIP-1表达水平,与空白对照组及空载体组比较分析,差异有统计学意义[空白对照组:(0.6627 ± 0.1707);空载体组:(0.6966 ± 0.1107);siRNA组:(0.1428 ± 0.0296),P<0.05]。流式细胞分析术显示,NUFIP-1 siRNA感染组在LPS刺激后较空白对照LPS 24 h组及空载体LPS 24 h组DC2.4凋亡率显著升高[空白对照LPS 24 h组:(47.91%±1.006%);空载体LPS 24 h组:(70.26% ± 1.011%);siRNA LPS 24 h组:(80.23% ± 2.094%),P<0.01]。Western blot分析进一步证实,NUFIP-1 siRNA感染组相较空白对照组及空载体组在LPS刺激下DC2.4凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3表达显著增强[空白对照LPS 24 h组:(0.4748 ± 0.0876);空载体LPS 24 h组:(0.2849 ± 0.0418);siRNA LPS 24 h组:(0.9733 ± 0.0525),P<0.01],抗凋亡蛋白Bcl-2表达则明显下调[空白对照LPS 24 h组:(0.7810 ± 0.0490);空载体LPS 24 h组:(0.8292 ± 0.0729);siRNA LPS 24 h组:(0.3957 ± 0.0838),P<0.05]。结论LPS刺激后DC2.4中NUFIP-1介导核糖体自噬明显活化,且对DC2.4凋亡具有显著保护效应。
简介:摘要肾纤维化是各种病因导致的慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)进展至终末期肾病的共同病理变化,其治疗研究一直受到广泛关注,改善肾纤维化所致的肾功能障碍被认为是治疗CKD的重要策略。自噬作为一种进化上高度保守的细胞内降解系统,已被证实与肾纤维化的发生发展密切相关。其中,肾脏固有细胞自噬变化对肾纤维化的影响被研究得较多;然而,自噬对肾纤维化的作用可能是细胞特异性及疾病环境依赖性的,即在不同的细胞或不同的疾病模型可能有截然相反的作用。因此,自噬对肾纤维化的作用仍然存在一定的争议。本文就肾脏固有细胞自噬在不同疾病条件下对肾纤维化作用的研究进展进行综述。
简介:摘要钙稳态失衡和自噬异常是PD、AD及肌萎缩侧索硬化症(ALS)等神经退行性疾病的重要发病机制,二者之间存在相关性。研究显示,细胞不同储钙区室可经钙通道或钙离子(Ca2+)相关信号蛋白影响自噬,例如细胞膜钙释放激活钙通道调节分子1(Orai1)和瞬时受体电位通道(TRPC)、内质网钙通道肌醇1,4,5-三磷酸受体(IP3R)途径、线粒体Ca2+摄取相关的钙单向转运体(MCU)、溶酶体钙通道瞬时受体电位通道粘蛋白1(TRPML1)和两孔通道、胞浆钙调素依赖蛋白激酶的激酶β(CaMKKβ)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)途径等。本文现围绕神经退行性疾病中细胞内不同储钙区室和胞浆Ca2+调控自噬的研究进展进行综述,以期加深临床同道对其的认识。
简介:摘要目的探讨自噬对Sprague-Dawley(SD)大鼠梗阻性黄疸肝损伤的影响及其机制。方法健康雄性SD大鼠35只,SPF级,6~8周龄,200~300 g,分为5组:假手术组(单纯游离胆总管,不结扎,腹腔内注射生理盐水)、胆总管结扎(OJ)组(游离胆总管,并双重丝线结扎,腹腔内注射生理盐水)、OJ+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、OJ+雷帕霉素(Rapamycin)组和OJ+3-MA+VX-765组,每组7只。HE染色观察肝脏组织学变化。免疫组化染色检测自噬相关蛋白Atg5表达水平。全自动生化仪检测肝功能。酶联免疫吸附试剂盒检测血清白细胞介素(IL)-18水平。蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白水平及内质网应激相关凋亡通路。结果通过免疫组化染色,OJ组自噬相关蛋白Atg5相对表达量较假手术组增加[(5.0±1.0)比(2.8±1.3)],差异有统计学意义(t=-3.00,P<0.05)。与假手术组比较,OJ组自噬活性增加,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-1/p-65及炎症因子IL-18水平升高,同时内质网发生应激并诱导其相关性凋亡。应用自噬抑制剂3-MA后,与OJ组比较,OJ+3-MA组中Caspase-1/p-65蛋白水平及炎症因子IL-18水平增加,同时肝损伤加重;而应用自噬激动剂Rapamycin后,与OJ组比较,OJ+Rapamycin组中Caspase-1/p-65蛋白水平及炎症因子IL-18水平下降,同时肝损伤减轻。应用Caspase-1特异性阻断剂VX-765后,与OJ+3-MA组比较,OJ+3-MA+VX-765组中Caspase-1/p-65蛋白水平及炎症因子IL-18水平下降,同时肝损伤减轻。结论胆总管结扎后,诱导内质网应激相关性凋亡及激活自噬。活化的自噬减轻SD大鼠梗阻性黄疸肝损伤,可能与抑制Caspase-1/p-65炎症通路相关。
简介:摘要目的探讨尼古丁在脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤炎症反应中的作用及机制。方法本研究为实验研究。动物实验部分,应用LPS构建急性肺损伤小鼠模型,将C57BL/6J小鼠24只,按体质量排序,采用蛇形分组法分为4组,每组6只,对照组、LPS组、LPS+尼古丁组、LPS+尼古丁+3-MA组。留取肺组织行HE染色,肺泡灌洗液行酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素1β(IL-1β)水平。细胞实验部分,采用MH-S细胞系,分为4组,对照组、LPS组、LPS+尼古丁组、LPS+尼古丁+3-MA组,取细胞上清液行ELISA检测IL-1β水平,采用细胞裂解液提取总蛋白行蛋白免疫印迹法检测NLRP3、Pro-caspase1、Cleaved-caspase1、LC3BⅡ、LC3BⅠ、P62蛋白水平,免疫荧光检测LC3B表达,透射电镜观测自噬小体数量。结果LPS组较对照组,肺组织出现明显炎性细胞浸润。支气管肺泡灌洗液和MH-S细胞上清液中IL-1β水平升高;LPS+尼古丁组较LPS组,肺组织炎性细胞浸润减轻,支气管肺泡灌洗液和细胞上清液中IL-1β水平降低;LPS+尼古丁+3-MA组较LPS+尼古丁组,肺组织炎性细胞浸润加重,支气管肺泡灌洗液和MH-S细胞上清液中IL-1β水平升高,差异均有统计学意义(F值分别为446.40、656.40,P值均<0.001)。蛋白免疫印迹法检测各组MH-S细胞裂解液,LPS组较对照组NLRP3、Pro-caspase1、Cleaved-caspase1表达水平升高,LPS+尼古丁组较LPS组NLRP3、Pro-caspase1、Cleaved-caspase 1表达水平下降,LPS+尼古丁+3-MA组较LPS+尼古丁组NLRP3、Pro-caspase1、Cleaved-caspase1表达水平升高,差异均有统计学意义(F值分别为180.00、301.70、105.80,P值均<0.001)。使用透射电镜观察4组MH-S细胞自噬小体,采用蛋白免疫印迹法检测4组MH-S细胞中P62及LC3BⅡ/LC3BⅠ表达显示,与对照组比较,LPS组自噬小体数量增多,P62表达水平降低,LC3BⅡ/LC3BⅠ升高;LPS+尼古丁组较LPS组自噬小体数量增多,P62表达水平降低,LC3B Ⅱ/LC3BⅠ升高,LPS+尼古丁+3-MA组较LPS+尼古丁组自噬小体数量减少,P62表达水平升高,LC3B Ⅱ/LC3BⅠ降低,差异均有统计学意义(F值分别为45.25、152.00、137.40,P值均<0.05)。结论尼古丁通过增强自噬减弱LPS诱导的急性肺损伤炎症反应及NLRP3炎症小体的活性。
简介:摘要目的探讨放射诱导多倍体结肠癌细胞的凋亡和自噬。方法采用14 Gy剂量的X射线处理SW1116细胞,分别在放射处理后的第3天、第5天、第7天、第10天及第25天观察细胞的形态变化,分别记为A组、B组、C组、D组和E组;在第5天、第25天用流式细胞术检测细胞倍性、细胞凋亡的变化;采用Western blot检测细胞周期、凋亡和自噬相关蛋白的表达。结果经14 Gy处理后,SW1116细胞出现多倍体化并伴随细胞体积增大,细胞发生凋亡和自噬。B组多倍体细胞亚群(DNA含量>4 N)比例[(57.50±2.33)%]和凋亡细胞亚群比例[(14.63±1.90)% ]均高于未放射组细胞[(1.90±0.17)%、(7.57±1.42)%],差异有统计学意义(P<0.05)。B组细胞周期相关蛋白周期素B1、细胞分裂周期基因2(cdc 2)表达上调,凋亡抵抗相关蛋白存活蛋白表达上调,自噬相关蛋白自噬微管相关蛋白轻链3(LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,自噬特异性底物选择性自噬接头蛋白(p62)蛋白表达下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论结肠癌多倍体细胞可能通过上调细胞周期相关蛋白、抗凋亡相关蛋白和激活自噬,来维持多倍体细胞存活并发生去倍化增殖,参与多倍体细胞的放射抵抗性和治疗后肿瘤的复发。
简介:摘要目的:探究高糖诱导体外培养的视网膜Müller细胞自噬及凋亡的变化。方法:实验研究。将体外培养的SD大鼠视网膜Müller细胞根据不同糖浓度分为5.5 mmol/L葡萄糖组(正常组)及20、30、40、50 mmol/L高糖组,并对40 mmol/L高糖处理Müller细胞组采用不同时间3、6、12、24、36 h进行培养。使用蛋白免疫印迹法及细胞免疫荧光检测自噬指标LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、自噬信号通路P62、Beclin-1蛋白表达及细胞定位;使用透射电镜及GFP-LC3慢病毒转染观察自噬小体的形成情况;使用TUNEL实验检测细胞凋亡状态。不同组别间数据比较采用单因素方差分析。结果:正常组及20、30、40、50 mmol/L高糖组中Müller细胞质的Beclin-1、P62及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白相对表达量总体比较,差异均有统计学意义(F=131.21,P=0.029;F=197.25,P=0.012;F=100.02,P=0.045),其中与正常组比较各浓度高糖组Müller细胞质内Beclin-1、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白均明显降低(P<0.05),P62蛋白相对表达量明显增加(P<0.001)。正常组以及6、12、24、36 h高糖组中Müller细胞质的Beclin-1、P62及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白相对表达量总体比较,差异均有统计学意义(F=98.46,P=0.015;F=109.48,P=0.004;F=99.27,P=0.032),其中6 h高糖组LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白明显增加(P=0.002、0.015),12、24、36 h高糖组与正常组相比较LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白均明显下降(P<0.05),P62蛋白明显增加(P<0.001)。正常组及6、24 h高糖组视网膜Müller细胞中GFP-LC3转染阳性颗粒、自噬小体相对数量组间总体差异有统计学意义(F=240.49,P=0.014;F=198.98,P=0.001),其中与正常组比较,6 h高糖组GFP-LC3转染阳性颗粒、自噬小体相对数量增加(P=0.002、0.029),24 h高糖组明显降低(P=0.019、0.036)。正常组及6、24 h高糖组及3MA组视网膜Müller细胞凋亡指数分别为3.14±1.01、15.34±3.87、25.82±4.96、24.79±4.01,总体比较差异有统计学意义(F=234.12,P=0.003),与正常组比较,6、24 h高糖组TUNEL阳性细胞增多(P=0.022、0.039),24 h高糖组与6 h高糖组比较TUNEL阳性细胞进一步增加(P=0.017)。结论:高糖诱导体外培养的视网膜Müller细胞早期自噬增加,细胞凋亡抑制,随着时间不断延长,高糖抑制自噬形成,增加细胞凋亡。高糖抑制自噬可能是促进Müller细胞凋亡的重要原因。
简介:摘要目的探索构建基于自噬相关基因(ARGs)肺鳞状细胞癌(LUSC)预后风险评分模型并分析。方法通过GeneCards数据库获得4 418个ARGs。从TCGA数据库收集了551例LUSC患者的基因表达谱及临床数据,提取所有ARGs的表达数据,利用R软件筛选差异表达的ARGs。对差异表达的ARGs进行富集分析。利用Cox回归模型构建ARGs的预后风险评分模型。根据风险评分计算公式计算出每个样本的风险评分,以中位数为cut-off值,将患者分为高风险评分组和低风险评分组。绘制多指标受试者工作特征曲线并计算风险评分评估模型性能。最后利用单因素和多因素Cox回归分析评价模型是否具有独立预后价值,并分析其临床相关性。利用外部数据集对其验证。结果初步筛选了50个有预后价值的差异表达的ARGs,以此为基础,利用Cox回归分析构建了由5个ARGs(LAMP2、TUSC1、CDKN1A、ITGB1、RGS19)组成的LUSC预后风险评分模型。该模型中,低风险评分组与高风险评分组的生存时间比较差异有统计学意义(3.032年比2.275年,t=3.23,P<0.001)。风险评分在单因素和多因素Cox回归分析中与LUSC患者预后比较差异均有统计学意义(P值均<0.001),提示风险评分可作为LUSC潜在的独立预后因素。并且,与外部数据集交叉验证仍有良好预测效果。临床特征相关性分析表明高风险评分与年龄、性别和发生不良预后密切相关。结论构建了一个由5个ARGs组成的LUSC风险评分模型,该模型可为预测LUSC患者预后提供参考,未来或可与恶性肿瘤分期联合应用于LUSC患者的预后预测。