简介：目的：采用Clontech公司第3套酵母双杂交系统，筛选与甲状旁腺素1型受体（PTH1R）相互作用的蛋白。方法：将全长P册JR基因克隆到载体pGBKT7作为诱饵，用LiAc介导将诱饵蛋白质粒pGBKT7-PTHIR和人肾cDNA文库质粒转化到酵母菌AH109中，检测Mell报告基因的表达，并进行相互作用的验证。结果：测序和相互作用验证结果表明SNAPIN在酵母系统中能特异地与PTH1R相互作用；根据对SNAPIN基因的功能分析，其可能与细胞内钙稳态的调控有关。结论：为进一步研究PTH1R促进骨肉瘤进展的机制提供了一定的线索。

简介：大环内酯类抗生素基因工程是近年来生物工程领域研究的一个热点,利用基因工程改造大环内酯类抗生素合成基因,已经合成了100多种"非天然”的天然化合物,为筛选新抗生素开辟了新的途径.本研究以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模板,先用PCR扩增出红霉素合成基因eryKR6两侧片段,再用重叠PCR将其拼接成去除KR6的约3.2kbDNA片段,并克隆于pWHM3载体,构建了同源重组质粒pWHM2201.用PEG介导将pWHM2201转入糖多孢红霉菌A226原生质体.PCR鉴定和生物活性检测均显示pWHM2201已重组到红霉素合成基因位点.在无抗性R3M斜面上生长两代后,制备重组体原生质体,并涂R3M平皿.利用PCR筛选出KR6敲除的突变体糖多孢红霉菌M.

简介：利用氨基酸密码子的简并性及大肠杆菌中高表达真核基因时,转录起始区的结构特点:①在起始密码子ATG后使用富含嘌呤的密码子延长其mRNA同tRNA反密码子loop的互补;②通过应用富含A/U的密码子,避免mR-NA形成稳定的二级结构;③减少潜在的第二个Shine-Dalgarno序列。通过聚合酶链式反

简介：目的：获得抑制效果好的泛素C端水解酶LI（UCH—L1）基因小干扰RNA（siRNA）干扰载体。方法：根据Gen—Bank中大鼠UCH—L1基因序列设计并合成4对siRNA寡核苷酸序列，将4对寡榱苷酸序列退、k成双链后分别插入siRNA表达载体pcDNA6．2-GW／EmGFP—miR中构建4个siRNA表达质粒，测序鉴定后将4个siRNA表达磺牝分别转染HEK293细胞，利用Western印迹和qPCR方法检测干扰效果；将干扰效果最好的质粒包装成腺病毒，感染大汛血管平滑肌细胞（VSMC），并采用TNF-a干预诱导UCH—Ll表达升高，Western印迹验证干扰效果。结果：测序分析证实4对siRNA寡核苷酸序列分别插入siRNA表达载体pcDNA6．2-GW／EmGFP—miR；qPCR检测与Western印迹均表明第3号siRNA表达载沐对UCH—Ll表达的抑制程度最高，将其包装成腺病毒并转染VSMC能显著抑制TNFd湾导的U（：H—I。l表达升高。结论：构建并筛选出干扰效果好的UCH—LlsiRNA干扰载体。

简介：以pBRTM/HCV-3011模板,通过PCR法扩增ns5a、LISDR(左端序列)和RISDR(右端序列),分别经XhoⅠ/EcoRⅠ、XhoⅠ/HindⅢ和EcoRⅠ/HindⅢ双酶切,连入穿梭质粒pEGFP-N3中,构建重组质粒pEGFP-N3-ns5a和pEGFP-N3-ns5a-△ISDR.对重组质粒进行酶切分析和序列测定.将这2种重组质粒通过电穿孔法转染HeLa细胞,然后在G418选择压力下进行有限稀释法筛选,用RT-PCR和荧光显微镜鉴定.经酶切鉴定和基因测序证实,重组穿梭质粒已插入目的片段ns5a、LISDR和RISDR.RT-PCR和荧光显微镜检测到目的基因的表达.以上结果说明成功构建了真核表达载体pEGFP-N3-ns5a和pEGFP-N3-ns5a-△ISDR,目的基因在HeLa细胞中得到表达,为研究HCVNS5A中是否存在抗干扰素治疗的功能蛋白提供了实验材料.

简介：为了研究通过功能筛选得到的一个新的红细胞分化相关的全长cDNA(命名为EDRFI)的功能,选择K562细胞作为模型细胞来观察反义EDRFI表达对细胞功能的影响.通过快速构建,同时得到了正向和反向插入片段的真核表达载体pcDNA3-EDRFI-S(sense)及peDNA3-AS(antisense),并通过改进的LipofectAMINE细胞转染和G418筛选,得到了稳定表达的细胞株,进行基因组PCR鉴定,证明了转染的高效性.NorrhemB10t试验的结果表明,反义载体转染的K562细胞中,EDRF1在mRNA表达水平上受到下调,提示EDRF1反义DNA的表达可能抑制了EDRF1mRNA的正常转录.进一步,γ-珠蛋白和PKC-α的表达在反义构建质粒转染K562细胞中的表达均受到下调,这可能传递了红细胞分化的负反馈信号,从而抑制了珠蛋白的合成.

简介：目的:设计合成新型2-喹诺酮类Polo样激酶1(Plk1)抑制剂。方法:以Plk1抑制剂ON01910为先导化合物,利用生物电子等排原理设计一系列2-喹诺酮类衍生物,用Autodock软件将该类化合物与Plk1进行分子对接和虚拟筛选,计算结合自由能;以取代的氯(溴)苄为起始原料,先后经巯基乙酸取代、双氧水氧化、与(对甲氧基)苯胺酰化,再经环合、水解制得目标化合物。结果:设计的化合物大多数与Plk1的结合自由能均比ON01910的低,结合强度高、稳定性好;合成了16个2-喹诺酮类衍生物,产物结构经1H-NMR确证。结论:所得化合物中有15个为新化合物,化合物的结构设计科学合理,虚拟筛选结果良好,为后续实体筛选和化合物结构优化提供了理论依据和参考。

简介：目的：筛选1型人免疫缺陷病毒（HIV-1）中国流行株中包膜蛋白gp41的优势抗原片段,构建具有区域流行代表性的HIV-1gp41重组抗原,为改进现有HIV-1初筛试剂盒中使用的同类抗原奠定基础。方法：利用免疫斑点杂交和生物信息学方法,从收集自重庆、广州、上海的区域代表性150份HIV-1感染者血清标本中筛选gp41抗原性强的候选样本,利用RT-PCR及巢式PCR方法扩增包含重要抗原表位决定蔟的gp41基因片段,与原核表达载体pQE30连接,转化大肠杆菌M15构建gp41重组抗原表达菌株,表达后经亲和层析纯化、SDS-PAGE和Western印迹鉴定。结果：兔源HRP标记的gp41多抗能识别标本中gp41抗原性差异,得到候选样本,扩增包含gp41主要抗原表位片段;构建了包含gp41抗原表达簇的重组原核表达质粒,表达、纯化后经His标签抗体Western印迹鉴定为阳性。结论：高纯度的重组优势gp41抗原的构建和鉴定,为进一步改进现有HIV初筛诊断奠定了基础。

简介：目的:探讨核酸适体KMF2-1a为基础的乳腺癌细胞靶向化疗药物载体的应用价值。方法:采用细胞仪检测人体乳腺癌MCF-1OAT1细胞内吞KMF2-1a的药物载体的作用,其结果以分光光度计检测。结果:核酸适体KMF2-1a及其药物载体可被MCF-1OAT1细胞特异性内吞。结论:核酸适体KMF2-1a可用于靶向治疗乳腺癌。

简介：利用同源模建方法预测了t-PAK1区的三维结构。通过结构叠合确定了t-PAK1、K2区,纤溶酶原K1、K4区及UKK区的赖氨酸结合口袋。静电势计算及疏水性分析表明,在t-PAK2区以及纤溶酶原K1、K4区与纤维蛋白裸露的赖氨酸之间存在明显的静电势互补和疏水面契合。确定了影响Kringle区结合口袋与赖氨酸亲和的重要氨基酸,分析了t-PAK1区、UKK区不能结合赖氨酸的原因,由此设计了具有赖氨酸亲和力的新型t-PAK1区及UKK区突变体。利用模拟残基突变技术预测了突变体的结构变化,分析了突变后t-PAK1区及UKK区与赖氨酸亲和力的变化,初步在理论上肯定了设计方案的合理性。

简介：乙肝病毒前S1抗原含多个免疫优势表位及乙肝病毒肝细胞受体结合位点,具有重要的生物学功能.为使其高效、可溶性表达,在DnaStar软件辅助分析下,将前S1基因5′端复杂二级结构突变后,克隆入原核表达载体pQE-30a,转化大肠杆菌M15感受态细胞,经IPTG诱导后,获得了高水平、可溶性表达;并对其进行了纯化和鉴定,为进一步研究乙肝病毒前S1抗原的结构功能特点奠定了基础.

简介：选择60Coγ射线5Gy照射后第7天的人胚肺成纤维细胞(HELF),采用聚阳离子脂质体LipofectAMINE介导的基因转染法将人TGFβ1正、反义基因表达载体pMAMneo-TGFβ1和pMAMneo-AntiTGFβ1转入HELF,转染细胞经G418抗性筛选出来.提取培养细胞的染色体DNA,用DNA斑点印迹分析表明,它们能与neo基因特异杂交.用neo基因特异的PCR引物能从转染细胞扩增出276bp的阳性片段,而未转染细胞则扩增阴性.

简介：目的：构建GFE-1多吠与重组人肿瘤坏死因子d（rmhTNF一仅）融合蛋白（GFE-1-rmhTNF），研究该融合蛋白的体外活性和体内分布。方法：利用基因工程方法，将人工合成的编码GFE—l的寡核苷酸片段连接在rmhTNF—d序列的3’端，转入大肠杆菌中诱导表达，采用Q—SepharoseFF阴离子层析柱和SP—SepharoseFF阳离子层析柱纯化蛋白，SDS—PAGE和Western印迹鉴定，测定该融合蛋白的体外活性，观察其在小鼠体内的分布情况。结果：构建了融合蛋白GFE-1-rmhTNF，并在大肠杆菌中获得高效表达。体外活性实验显示，GFE-1-rⅢhTNF对L929细胞有明显的杀伤活性；体内分布实验证实，GFE-I-rmhTNF在小鼠肺组织的富集远高于肝肾组织。结论：构建了融合蛋白GFE-1-rmhTNF．，可显著杀伤L929细胞并特异性富集于小鼠肺组织。

简介：与许多在细胞浆内复制的RNA病毒不同，流感病毒的复制及转录都在细胞核内进行。流感病毒感染细胞进入细胞浆后，经病毒脱壳将病毒核糖核蛋白体复合物（vRNP）释放到细胞浆。vRNP含有病毒的RNA基因和碱性聚合酶1（PB1）、碱性聚合酶2（PB2）、酸性聚合酶（PA）及核蛋白（NP）。vRNP被主动运送到细胞核内，开始病毒基因组的复制和转录。流感病毒感染细胞的晚期，在细胞浆中新合成的PB1、PB2、PA及NP蛋白也需要进入细胞核，参与新的vRNP的装配。我们简要介绍有关流感病毒vRNP和新合成的PB1、PB2、PA及NP蛋白进入细胞核的机制。