简介:摘要目的研究两种支原体快速检测方法在病毒载体制品中的适用性和影响因素。方法采用基于PCR技术的两种支原体核酸扩增检测方法,对分别表达Ⅱ型单纯疱疹病毒抗原gD和ICP27的重组仙台病毒载体疫苗(SeV-dF/HSV-2 gD、SeV-dF/HSV-2 ICP27)收获液及纯化液进行支原体检测,探究其特异性和最低检测限,并对多个批次的收获液及纯化液进行测定。结果普通PCR法在对本制品病毒收获液检测时无明显PCR抑制现象,但对病毒纯化液检测时发生明显的PCR抑制,并且未能检出100 CFU/ml限度的口腔支原体和肺炎支原体。实时荧光定量PCR法在对本制品病毒收获液和纯化液的支原体检测中均无PCR抑制发生,且该方法对口腔支原体、肺炎支原体等多种支原体的检测灵敏度可达到10 CFU/ml,其中对口腔和肺炎支原体核酸拷贝数检测灵敏度可达到每毫升50基因组拷贝。结论实时荧光定量PCR法具有更高特异性和灵敏性,适用于作为质量内控方法快速检测病毒载体制品,及时发现支原体的污染,保证制品质量。
简介:摘要目的建立基于SYBR Green I颜色判定的检测新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)ORF1ab基因的逆转录环介导等温扩增方法(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP),为诊断SARS-CoV-2提供简便、快速和准确可靠的工具。方法基于GenBank中SARS-CoV-2 ORF1ab基因序列保守区设计引物,经引物筛选和RT-LAMP反应体系优化后进行灵敏度和特异性评价,并与实时荧光定量RT-PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法进行比较。结果基于颜色判定的RT-LAMP方法可在65℃45 min内完成SARS-CoV-2的快速检测,检测限为3 copies/reaction,与qRT-PCR的敏感度一致。RT-LAMP检测人冠状病毒OC43、人冠状病毒NL63和乙型流感病毒核酸样本结果为阴性,具有较好的特异性。经SARS-CoV-2临床样本验证,RT-LAMP与qRT-PCR的检测符合率达100%。结论基于颜色判定的RT-LAMP方法灵敏度高、特异性强,适用于SARS-CoV-2的快速可视化检测,具有应用于SARS-CoV-2样本的初筛及基层卫生医疗机构和现场推广的潜力。
简介:摘要MYCN基因在神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)细胞生长、凋亡、分化、浸润、转移及血管形成等方面发挥重要作用。临床中,MYCN基因扩增是NB危险度分级的重要指标之一。然而,MYCN基因检测面临检测方法操作复杂、检测成本高及不易获得瘤组织细胞等问题。研究表明,NB患儿血清循环MYCN基因扩增情况与瘤组织中一致,血清循环MYCN基因扩增情况作为NB预后及复发监测指标具有灵敏度高、特异性好、操作简便及无创等优势。因此,血清循环MYCN基因扩增检测有望替代瘤组织中MYCN基因扩增检测,用于NB预后及复发监测。本文通过介绍NB患儿血清循环MYCN基因扩增情况在NB诊断、预后及复发监测中的应用研究进展,并对其未来发展进行展望,以期推进其临床转化应用的速度。
简介:摘要目的建立环介导等温扩增技术(LAMP)用于检测B7-H3基因,以评价肿瘤患者的预后转归。方法收集临床病理阳性样本并用荧光定量PCR检测,然后根据B7-H3基因序列设计LAMP引物并优化反应条件。用LAMP方法检测收集的临床样本,计算阳性率,并比较LAMP和荧光定量PCR的统计学差异。结果建立的LAMP体系特异性和灵敏性良好。通过对临床样本的检测,B7-H3阳性样本的LAMP检测结果和荧光定量PCR差异有统计学意义(P<0.05)。结论LAMP对B7-H3基因的检测具有较好的特异性,操作简便,适合在基层医院应用。
简介:目的为了提高输血安全性,探讨国产核酸扩增试剂在血站血液乙型肝炎病毒(HBV)筛查中应用的可行性。方法在酶联免疫吸附试验(EUSA)常规筛查血液乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的基础上,采用荧光聚合酶链反应(PCR)技术(国产核酸扩增试剂)对初、复检合格的献血者的血清汇集标本(8人份×150μL)进行HBVDNA检测,对初始反应阳性的汇集标本拆分后再进行单份检测,用国家标准质控品考评检测限量,用已知HBVDNA阳性血样评估检出情况。结果应用国家HBVDNA标准品考评,本方法的95%检测限量为98.0IU/mL,可信限范围为[55.8,5487。对9611份标本共1208个汇集池进行检测,初始检测阳性池7个,阳性率为0.58%,进一步拆分检测,未检出HBVDNA阳性标本;对检测阴性的汇集标本随机进行234份单份检测(1400μL上样浓缩),亦未检出HBVDNA阳性标本。结论同国际知名核酸检测试剂相比,国产核酸扩增试剂的灵敏度和特异性有待进一步提高。
简介:摘要目的运用逆转录解旋酶等温扩增(RT-tHDA)和侧流层析技术,建立新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测新方法。方法收集2020年1至4月东部战区总医院基础医学实验室共143份2019-nCoV PCR阴性核酸标本和20份PCR阳性核酸标本。针对2019-nCoV N基因和E基因保守区序列各设计5对引物,扩增产物进行凝胶电泳分析,筛选出RT-tHDA最佳引物。分别扩增高浓度(5×105 拷贝/ml)、低浓度(5×102拷贝/ml)模拟标本,利用侧流层析试纸条(LFD)检测RT-tHDA扩增产物,使结果可视化。优化显色和扩增时间,建立tHDA-LFD最佳反应体系。该方法检测各低、中、高3种浓度的模拟标本15次,以阳性符合率来评估方法学精密度。制备模拟标本评价方法学检测限。分别检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、冠状病毒229E,评价tHDA-LFD法的交叉反应性。采用tHDA-LFD法检测本实验室收集保存的163份标本,进行临床诊断效能评价。结果采用一步法RT-tHDA结合LFD,建立扩增时间为60 min的2019-nCoV核酸检测方法。该方法检测3种浓度的模拟标本,阳性符合率为100%,精密度和重复性较好,且与其他6种呼吸道病原体均未出现交叉反应。该方法检测N基因、E基因的最低检测限均为5×102 拷贝/ml。诊断效能评价结果显示,该法敏感度为95.00%(19/20),特异度为100.00%(143/143),阳性预测值为100.00%(19/19),阴性预测值为99.31%(143/144)。和金标准qPCR法相比,两种方法的Kappa值为0.971(P<0.000 1),一致性较好。结论本研究成功建立了基于tHDA-LFD法的2019-nCoV可视化检测方法。
简介:本研究旨在探讨不同时期的胎盘组织悬液对脐血造血干细胞体外扩增的作用,进一步了解随着胎龄的增长胎盘造血功能发生的变化。应用早期(B组)、中期(C组)和足月(D组)胎盘绒毛组织悬液,并设定空白对照(A组),以共培养的方式分4组进行体外扩增脐血造血干细胞并培养观察扩增后的集落形成能力。结果表明,以接种初浓度为对比,共培养7d后A组细胞呈逐渐衰减趋势,B组扩增效果不明显,仅为扩增前的1.40±0.20倍,C组和D组造血干细胞均能有效扩增,扩增倍数分别为2.93±0.50和4.80±0.40。集落培养14d后的结果显示,C、D组集落形成总数明显高于A、B组,C组CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E集落数均略高于D组。结论:在没有外源性细胞因子存在的情况下,不同时期的胎盘绒毛组织悬液均可以支持造血干细胞的体外扩增,且随着胎盘发育其支持造血的功能呈不断增强的趋势。扩增后的造血干细胞的集落形成能力却呈先增强后减弱的现象,中期胎盘培养扩增后的干细胞集落形成能力最强,略强于足月期胎盘扩增后的造血干细胞。
简介:目的通过改进和优化多重扩增阻滞突变系统-PCR(multi-ARMS-PCR)条件,建立载脂蛋白E(ApoE)基因的简易分型方法。方法基于multi-ARMS-PCR的原理和特点,针对文献报道方法中存在的缺陷和错误,重新设计或改进引物。以外周血白细胞基因组DNA为模板,应用4个等位基因特异性寡核酸上游引物、1个通用下游引物和一对内参引物,分A,B两个管同步进行多重PCR反应。PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳分离-EB染色,根据电泳带型的差异,实现对ApoE6种基因型的判定。结果新引物显著提高了扩增效率和反应特异性,排除了非特异条带的干扰,减少了ApoE基因分型的错判。结论采用优化后的multi-ARMS-PCR方法对ApoE基因型进行鉴定,具有操作简便、时间短、效率高、成本低的优点,值得推广。
简介:【摘 要】目的:本次研究多通道荧光探针的滚环扩增技术应用在结核分枝杆菌耐药基因的检测中的应用。方法:通过多通道荧光探针(HEX/FAM/ROX)对滚环扩增产物精准捕获与信号放大,实现对三种突变基因的单管多重检测。结果:通过应用多通道荧光探针的滚环扩增技术,同一反应体系中中katG315的响应范围为1.5 pmol/L至0.1 5nmol/L, rpoB531和rpsL43的响应范围为1.5pmol/L至60.0 pmol/L和1.5 pmol/L至25.0 pmol/L,特异度与灵敏度较高,可精确识别单碱基突变;模拟血清样本回收实验中,回收率95.3%-105.5%。结论:多通道荧光探针的滚环扩增技术检测具有较高的特异性,耗时短,灵敏度高的优势,临床应用价值显著。