简介:目的分析高表达组蛋白去乙酰化酶(sirtuin1,SIRTl)对高糖高脂培养胰岛微血管内皮细胞(isletendothelialcells,IEC)内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达及活性的影响。方法合成含绿色荧光蛋白报告基因的小鼠SIRTl基因重组质粒,以Lipofectamine2000转染IEC后以高脂或高糖高脂处理48h。高脂组以0.5mmol/L棕榈酸处理;高脂高糖组以33.3mmol/L葡萄糖+0.5mmol/L棕榈酸处理。应用Westem印迹法检测SIRrll基因转染效果;应用实时荧光定量PCR及Western印迹法检测eNOS的基因及蛋白水平;应用硝酸还原酶法检测培养细胞上清中NO的水平。结果相对于正常对照组,高脂培养IECeNOS基因及蛋白水平无明显变化;但高脂高糖环境下,eNOS的基因及蛋白水平明显下降。高表达SIRT1不仅可升高高脂培养内皮细胞eNOS蛋白表达,且可升高高脂高糖培养内皮细胞eNOSmRNA及蛋白表达。相对于正常对照组,高脂培养使内皮细胞分泌NO水平明显下降,高糖高脂培养使内皮细胞NO水平进一步下降,高表达SIRT1不仅可升高基础状态下内皮细胞的NO水平,且可升高高脂、高脂高糖培养内皮细胞的NO水平,差异具有统计学意义。结论SIRT1可改善高糖高脂培养胰岛微血管内皮细胞的eNOS表达及活性,使内皮源性NO分泌增加,因而可能有助于改善胰岛B细胞功能,在糖尿病的药物开发、基因治疗及胰岛移植治疗中具有广阔的前景。
简介:摘要目的探讨高糖、高脂对2型糖尿病(T2DM)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中Ras鸟苷酸释放蛋白4(RasGRP4)表达水平的影响。方法纳入2016年8月至2017年2月于天津医科大学朱宪彝纪念医院住院的T2DM患者120例(T2DM组)和年龄、性别相匹配的健康志愿者50例(NC组),采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测受试者PBMCs中RasGRP4及其变异体mRNA的表达情况。采用双变量相关分析和多元线性回归分析糖尿病病程及主要临床指标与RasGRP4及其变异体mRNA表达水平之间的关系。采用不同浓度葡萄糖(低糖:5.5 mmol/L,高糖:12.5 mmol/L和25 mmol/L)、不同浓度的棕榈酸(低脂:0.2 mmol/L,高脂:0.5 mmol/L)及高糖高脂(25 mmol/L葡萄糖+0.5 mmol/L棕榈酸)分别处理人单核细胞系(THP-1)细胞6、12和24 h,采用RT-qPCR技术检测RasGRP4及其变异体mRNA的水平,采用蛋白质免疫印迹技术(Western blot)检测RasGRP4蛋白表达情况。结果与NC组相比,T2DM组PBMCs中RasGRP4 mRNA及其变异体a、b、c、d、f和g的mRNA水平均升高(t=4.308、5.432、5.654、5.931、4.018、3.958、5.073,均P<0.05),而变异体e的mRNA水平下降(t=-3.821,P<0.05)。双变量相关分析显示T2DM组RasGRP4 mRNA水平与病程、血清甘油三酯(TG)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、糖化血红蛋白A1c(HbA1c)呈正相关(r=0.973、0.237、0.472、0.245,均P<0.05);多元线性回归分析显示T2DM病程和HbA1c是主要影响因素。高糖、高脂可促进THP-1细胞表达RasGRP4,且高糖、高脂同时干预对RasGRP4表达的影响具有明显的协同促进作用。结论T2DM患者PBMCs内信号蛋白RasGRP4高表达且出现变异体,慢性高血糖、高血脂可能是激活RasGRP4及其变异体产生的重要因素。