简介：乙肝病毒前S1抗原含多个免疫优势表位及乙肝病毒肝细胞受体结合位点,具有重要的生物学功能.为使其高效、可溶性表达,在DnaStar软件辅助分析下,将前S1基因5′端复杂二级结构突变后,克隆入原核表达载体pQE-30a,转化大肠杆菌M15感受态细胞,经IPTG诱导后,获得了高水平、可溶性表达;并对其进行了纯化和鉴定,为进一步研究乙肝病毒前S1抗原的结构功能特点奠定了基础.

简介：为了研究提高血红蛋白粘聚体的稳定性，利用计算机同源模建、分子间氢键形成及表观静电势理论，探讨血红蛋白及相应突变体的结构与功能与功能关系。分析发现两个α９９位的Ｌｙｓ突变为Ｃｙｓ后，它们之间可以形成二硫键，两个β８２位的Ｌｙｓ突变为Ｃｙｓ可以增强形成分了间氢键的能力，分别起到稳定四聚体的作用。分析表明，突变体血红蛋白将具有更高的稳定性，从而提高血红蛋白稳定性及借助计算机工具设计新型奕变体提供参考。

简介：目的探讨前入路腹膜前间隙无张力疝修补手术和传统疝囊高位结扎手术的治疗效果.方法选取2013年8月到2014年11月我院收取的腹股沟疝气病人共87例,并随机分为对照组（n=43）和观察组（n=44）.对照组给予传统疝囊高位结扎手术,观察组给予前入路腹膜前间隙无张力疝修补手术,对比两组的手术、术后并发症情况.结果观察组手术时长、下床活动时间和住院天数显著短于对照组,差异有统计学意义（p〈0.05）;术后并发症比较,两组患者无统计学意义（P〉0.05）.结论在腹股沟疝治疗中,前入路腹膜无张力疝修补手术具有手术持续时间短、恢复时间短等优点,值得推广.

简介：PCR扩增了集胞藻PCC6803的slr1761基因,进一步以PGEM-T为载体将其克隆到大肠杆菌中,构建了P1761质粒。通过DNA体外重组,以卡那霉素抗性基因插入目的基因片段,构建了既含目的基因上游及下游序列、又携带选择性标记卡那霉素抗性的PK1761质粒。该质粒转化野生型集胞藻PCC6803细胞,利用同源重组原理获得了能在含卡那霉素的培养基上正常生长的基因敲除突变株。对该突变株基因组DNA进行PCR扩增,验证了其基因结构的正确性。

简介：T-DNA插入突变在植物功能基因组学研究中发挥着重要作用,广泛应用于大规模植物基因功能分析,是分离新基因、研究基因功能的有效工具。我们简单介绍了T-DNA插入突变的原理,详细论述了3种T-DNA插入突变载体的应用,并综述了利用T-DNA插入突变克隆新基因的方法,同时指出了T-DNA插入突变存在的问题及其发展方向。

简介：目的：研究柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌SIPI-1482中酮还原酶基因dnrU阻断后的产物（13s）-13-二氢柔红霉素及其他发酵产物的变化。方法：利用同源重组的原理，以大肠杆菌质粒pUC18为基础构建了dnrU基因交换质粒，通过在SIPI-1482染色体上的dnrU基因中插入安普霉素抗性基因来筛选dnrU的阻断突变株。结果和结论：PCR验证表明成功地阻断了dnrU基因。dnrU基因敲除后，重组菌发酵产物中（13s）-13-二氢柔红霉素消失，而其他发酵中间产物也有一定变化。

简介：利用重叠延伸PCR法对扩展青霉碱性脂肪酶(PEL)基因进行体外定点突变,并构建了含突变基因的重组质粒pPIC3.5K-lip-D92P.将该质粒在毕赤酵母GS115菌株中表达.与野生型表达产物PEL-GS相比较,突变体表达产物PEL-D92P-GS最适作用温度为45℃,比野生型提高了5℃;其热稳定性与野生型相当;突变体在40℃下的表达量为109U/mL,约为野生型的29%.结果分析表明,Pro替代Asp92后,可能是由于Pro一级结构的特点,使酶结构更加稳定,在高温下更适于与底物结合.

简介：应用DNA聚合酶链式反应(PCR)技术,对p16抑癌基因(CDKN2)进行体外定点突变,在p16cDNA中引入第48位密码子CCG(Pro)→CTG(Leu)和第74位密码子GAC(Asp)→AAC(Asn)突变,构建了p16-P48L和p16-D74N突变体。野生型和突变型p16cDNA克隆于pcDNA3构建pCMV-p16、pCMV-p16P48L和pCMV-p16D74N真核表达载体,导入纯合缺失p16基因的人肺癌细胞株H460,经RNA点杂交、RNA印迹和细胞免疫化学染色,检测到P16表达。通过比较表达野生型和突变型P16的H460细胞在~3H-TdR掺入及细胞所在周期的差异,证实P16表达抑制细胞进入S期,而P48L和D74N突变体对细胞进入S期没有什么影响,提示P48L和D74N突变导致P16蛋白功能丧失。

简介：目的：利用Red系统构建肠出血性大肠杆菌O157：H7的sRNA基因E40缺失突变株。方法：选取本实验室预测并经过实验验证的sRNA基因，根据NCBI上相应的序列，设计2对引物分别扩增该sRNA基因的上下游分别长464和455bp的同源臂，经PCR扩增，构建到相应的载体，最后以构建好的含上下游同源臂和卡那霉素抗性基因的长约2500bp的线性片段作为打靶片段，在Red重组系统的作用下与sRNA基因E40的上下游同源区域发生同组，从而把sRNA基因从基因组上置换下来，之后利用质粒pCP20将FRT位点间的卡那霉素抗性基因消除。结果与结论：构建了出血性大肠杆菌O157：H7的sRNA基因E40的缺失突变株，为进一步研究sRNA基因在出血性大肠杆菌O157：H7生长及致病过程中所起的功能奠定了良好的基础。

简介：目的：利用基因定点突变的方法将葡萄球菌肠毒素C2（SEC2）的31位定点突变,以获得抑瘤效果增强的肠毒素。方法：利用基因定点突变的方法,将SEC2中31位的His用Asn替代,转入大肠杆菌中诱导表达,采用CM弱阳离子层析柱纯化蛋白,并用SDS-PAGE和Western印迹对其进行鉴定,通过MTS法检测其体外抗肿瘤活性。结果：构建了突变体蛋白SEC2（H31N）,并在大肠杆菌中实现了高效表达。体外实验表明,在相同浓度下,SEC2（H31N）对多种肿瘤细胞的抑制作用明显优于野生型SEC2,尤其在低浓度下此现象更为明显。对于5个受试细胞株,SEC2（H31N）的IC50均低于SEC2;SEC2（H31N）浓度分别为0.01~10、0.01和0.1ng/mL时,对肿瘤细胞SMMC-7721、HepG2、A549的生长抑制率与SEC2相比均显著提高。结论：同野生型SEC2相比,突变体蛋白SEC2（H31N）对肿瘤生长的抑制作用得到了提高。

简介：目的：融合表达结核分枝杆菌Rv3881c突变子抗原，以便与其他已知的免疫显性抗原联合使用，有效增加结核分枝杆菌感染血清学检验的敏感性和特异性。方法：将克隆的来源干结核分枝杆菌H37Rv株的Rv3881c突变体基因插入原核表达载体pET24b，并在大肠杆菌BL21中获得高效表达；由于重组的Rv3881c突变子抗原片段同C端的6xHis标签融合表达，使用Ni-柱进行快速纯化。结果：Western印迹表明，重组的Rv3881c突变子抗原同选取的6例结核病阳性临床血清标本均能发生明显的反应。结论：重组Rv3881c突变体具有较好的特异性，提示该抗原可能成为检测结核的有效抗原之一。

简介：构建了二氢叶酸还原酶（dhfr）选择基因启动子上游无增强子（cnhancer）的组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）组合突变体FrGGI真核表达质粒pZLFrGGI。将pZLFrGGI酶切线性化,采用大剂量DNA电击介导法,转染dhfr基因缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系（CHO-dhfr-）。用氨甲喋呤（MTX）筛选转染细胞。混合加压后,挑选克隆,在1×10-7mol/LMTX压力下,得到了表达水平达1500～2500IU/106细胞·24小时的细胞株。此细胞株表达水平稳定,形态良好,倍增时间为36小时,且有进一步提高表达水平的潜能,有望发展为工程细胞株。

简介：目的：人肌球蛋白7A（MYO7A）基因是遗传性耳聋分子筛查的候选基因之一。从已知的MYO7A非同义单核苷酸多态性（nsSNPs）位点数据库中筛选可能与致病表型相关的nsSNPs位点,以提高MYO7A基因耳聋分子诊断的有效性和准确率。方法：首先,从NCBI数据中心的dbSNP数据库（dbSNP）和DeafnessVariationDatabase数据库获得MYO7A基因的SNPs数据和基因的相关信息;然后,通过SIFT、PolyPhen-2、PANTHER、PhD-SNP、MutationTaster、SNP＆GO和MutPred软件进行nsSNPs表型致病性分析,预测潜在致病位点;接着,应用ClustalX2和GeneDoc软件进行同源氨基酸序列比对,分析潜在致病的nsSNPs位点保守性;最后,应用SwissModel平台选择性地对某些突变蛋白质的三维结构进行建模,并分析结构域的变化。结果：预测出MYO7A的104个高风险致病的nsSNPs位点,包括25个已报道的耳聋相关nsSNPs位点;高风险致病的nsSNPs位点中,有42个位于肌球蛋白马达（myosinmotor）结构域,其中12个预测有致病风险的nsSNPs位点与MYO7A基因致聋的突变研究报道一致。肌球蛋白马达结构域中包含30个新预测的潜在致病性nsSNPs位点,其中仅L366P位点在7个预测软件中具有高度一致性。通过对L366P位点位点突变前后的三维模型构建,发现存在蛋白结构的改变,且同源性比对结果显示了该位点的高度保守性。结论：MYO7A的L366P为潜在高风险致病性nsSNP位点,推测该基因突变可能与耳聋表型相关。本研究所采用的分析筛选方法对MYO7A基因突变的临床筛查及其他致病基因的nsSNPs筛选具有重要的参考价值。

简介：在真核生物细胞中,许多具有生物活性的多肽和蛋白是在其分泌过程中由前体蛋白经内切蛋白酶切割后激活形成的.弗林蛋白酶(Furin)就是这个内切蛋白酶家族重要成员之一,它可以识别剪切多种蛋白质,如生长医子、血清蛋白、基质金属蛋白酶、受体、病毒囊膜蛋白和细菌外毒素等.近年来Furin得到了迅速而广泛的研究,本文简介了它的表达与加工运输、生物学功能、与病毒侵染的关系,以及它的抑制剂.

简介：本文作者已有的研究结果证明,完整的人干细胞生长因子(hSCGF)没有种属特异性,即可以作用于小鼠骨髓造血细胞.这一点与在Ca2+依赖糖识别结构域(CRD)缺失了78个氨基酸残基的截短分子(hSCGFβ)有所不同.本研究从hSCGF全长cDNA中完全删除了CRD结构域编码序列,进一步探讨CRD结构域的生物学功能.由于该突变体序列GC含量较高,因此将该缺失突变体序列克隆在GST融合表达载体中进行融合表达.通过低温(28℃)诱导,表达产物主要以可溶蛋白的形式存在.利用亲和层析纯化CRD结构域完全缺失的hSCGF突变体融合蛋白,通过检测重组突变分子的协同刺激造血活性有无改变来初步探讨CRD结构域在hSCGF分子中的生物学功能.研究结果表明,去掉完整CRD结构域的突变分子仍然具有造血刺激活性.据此推断CRD结构域在hSCGF分子中可能对于受体配体结合起辅助作用.

简介：目的：观察Kozak序列（＋4G）对稳定转染的人淀粉样前体蛋白（hAPP751）-EGFP融合真核表达载体在CHO细胞中表达的影响,为APP的水解代谢研究提供细胞模型。方法：分别将含Kozak序列（＋4G）和不含Kozak序列的hAPP751全长基因片段亚克隆入pEGFP-N1表达载体,得到pEGFP-hAPP751（＋4G）和pEGFP-hAPP751重组质粒,转染CHO细胞,通过G418筛选稳定转染细胞株,再用倒置荧光显微镜挑取绿色荧光强的细胞进行亚克隆,并观察融合蛋白的表达强度和细胞定位,最后用EGFP抗体通过Western印迹检测融合蛋白。结果：PCR、酶切和测序证明将含Kozak序列（＋4G）和不含Kozak序列的hAPP751全长基因片段分别连入了真核表达载体pEGFP-N1中;荧光显微镜下观察pEGFP-hAPP751（＋4G）稳定转染细胞的细胞膜和细胞质产生较强的绿色荧光,其中在细胞质中成不均匀颗粒状分布,Western印迹检测到相对分子质量约156000的融合表达蛋白,与预期相符;pEGFP-hAPP751转染细胞,其绿色荧光十分微弱且在整个细胞均匀分布,Western印迹检测到相对分子质量约26000的EGFP,但检测不到预期的hAPP751-EGFP融合表达蛋白。结论：Kozak序列（＋4G）可以明显促进hAPP751的表达,获得稳定转染且高水平融合表达hAPP751-EGFP的细胞株。