SITS在实验性心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用

【摘要】 　　目的阐明SITS所产生的心肌保护作用。方法建立缺氧/复氧损伤（A/R）模型及SITS预适应模型，测定心肌细胞的搏动频率、细胞存活率以及细胞培养液中LDH的变化。结果SITS预处理能明显提高A/R损伤后细胞存活率，减少LDH的漏出，与A/R组相比均有显著性差异（P<0.01）。结论SITS预处理对心肌细胞A/R具有保护作用。此研究为寻找特异性阻断剂，探讨心肌保护药物的新靶点提供理论与实验依据。

【关键词】 SITS 缺氧/复氧损伤 预处理 心肌细胞

　　自从Murry［1］发现“心肌缺血预适应保护作用”以来，研究缺血预适应保护条件及其机理探索等成为20世纪90年代以来国际上研究心肌保护的热点和前沿。动物实验发现使用Cl-通道及Cl-转运体系的抑制剂SITS（4-乙酰胺基4-异硫氐-2,2-二磺酸）可使多种原因诱导产生的心肌再灌注心律失常发生率显著降低，提示SITS在心肌缺血再灌注损伤中起重要作用。

　　本研究拟从细胞水平阐明SITS预处理对心肌细胞缺氧/复氧损伤（A/R）具有保护作用，进一步寻找特异性阻断剂，探讨心肌保护药物的新靶点。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物Spraguer-Dawley(SD)新生大鼠（1～3 d），雌雄不拘，由南昌大学医学院医学实验动物科学部提供。

　　1.2 试剂Trypsin，HEPES均购自Sigma公司， 其余化学试剂均为分析纯产品。

　　1.3 鼠心肌细胞培养参照Spector［2］等方法略加改进，取新生大鼠（1～3 d），在无菌状态下取心室肌部分剪碎，加入0.1%胰蛋白酶溶液反复消化制成细胞悬液，收集细胞于含15%胎牛血清的MEM培养基的培养皿中，然后置CO2培养箱（气体配比为5%CO2及95%O2空气，37℃）中培养。

　　1.4 实验分组与操作程序将细胞悬液调成细胞浓度为5×105 细胞/孔之后，按5×105 细胞/孔接种于24孔培养板，最后置CO2培养箱（37℃，气体配比为5%CO2及95%O2）中培养，隔天换培养液，头3 d加入0.1 mM BrdU抑制成纤维细胞生长。培养第4天随机分3组（n=8）进行实验：①正常对照（Control）组换培养液后置培养箱孵育28h。②A/R组更换培养液后置培养箱孵育24h，再缺氧3h复氧2h。③SITS预适应（SITS+A/R）组在心肌细胞培养液中加入各孔终浓度为2.05×10-4 mmol/L 的SITS预处理 3 h，其余处理同A/R组。

　　1.5 观察指标及方法实验各组结束后取培养上清液用倒置显微镜观察并计数各组心肌细胞搏动的频率。用生化分析仪测LDH活性、MTT比色法测细胞存活率。

　　1.6 统计分析定量资料以 +s表示，采用系统统计软件SPSS11.5进行单因素方差分析（One-way ANOVA），P<0.05为有统计学意义。2 结果

　　2.1 各处理组对缺氧复氧心肌细胞搏动的影响

　　实验结束后在倒置显微镜下观察并计录各组心肌细胞搏动的频率。正常对照组心肌细胞搏动相对恒定，节律规则； A/R组使心肌细胞搏动频率减慢、搏动幅度减弱、节律不齐，有部分停搏，部分细胞搏动幅度强弱不等，与control组相比，搏动频率有显著性差异（P<0.01）；SITS+A/R组对正常心肌细胞搏动频率（P>0.05）、搏动幅度、节律无明显影响，与A/R组比较有显著性差异（P<0.01）。结果见表1。表1 各处理组对心肌细胞搏动频率的影响（略）

　　2.2 各处理组对缺氧复氧损伤后心肌细胞存活率的影响与正常对照组比， A/R组心肌细胞严重受损，细胞存活率较control组降低60.1%（P<0.01 ）；SITS +A/R组明显减轻上述A/R损害性变化，与A/R组相比细胞存活率升高55.3%（P<0.01）。表明SITS预处理可明显对抗心肌细胞A/R损伤所致的细胞存活率下降之作用。结果见表2。表2 各处理组对心肌细胞存活率的影响（略）

　　2.3 各组对心肌细胞A/R损伤后 LDH 的影响与正常对照组比较， A/R 组细胞悬液中 LDH 增加10倍（P<0.01）；SITS +A/R 组与 A/R 组比细胞悬液中的 LDH 活性降低（P<0.01）；表明 SITS 预处理可对抗心肌细胞A/R损伤所致细胞培养液中 LDH 活性升高的作用。结果见表3。表3 各处理组心肌细胞 LDH 活性（略）

　　3 讨论

　　各种原因造成组织血液灌流量减少可使细胞发生缺血性损伤，恢复血液再灌注后，缺血性损伤进一步加重的现象称为缺血再灌注（I/R）损伤。早在20世纪50年代初，Harry 就首先提出 I/R 对缺血的心肌是有害的，能加重心肌缺血损伤。

　　本研究表明，SITS 预处理能明显提高 A/R 损伤后细胞存活率，减少 LDH 的漏出；与 A/R 组相比均有显著性差异（P<0.01）。随着对 SITS 心肌保护作用及机制的进一步了解，对寻找特异性阻断剂，探讨心肌保护药物的新靶点具有重要的意义。

【参考文献】
　　［1］Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium［J］.Circulation. 1986, 74: 1124.

　　［2］Spector DL, Goldam RD, Leinwand LA. Cells: A laboratory mannul. volum 1:culture and biochemical annlysis of cell［J］.Cold spring harbor laboratory press,1998, 11:1.