【摘要】 目的研究柴胡皂苷-d(SS-d)对乙醇损伤大鼠原代培养肝细胞保护的作用和机制。方法采用胰蛋白酶消化、分离大鼠肝细胞进行原代培养,乙醇体外诱导肝细胞损伤,以不同浓度的SS-d对肝细胞保护,检测培养液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性和肝细胞内丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性,MTT法检测肝细胞存活率。结果SS-d(1.0,2.0,3.0mg·L-1)明显改善肝细胞存活率,抑制乙醇引起的ALT活性的升高,对肝细胞中MDA含量升高和GSH-px活性降低均有明显的抑制作用。结论SS-d对乙醇损伤大鼠肝细胞有保护作用,其机制可能与SS-d清除自由基、抑制质脂过氧化作用有关。
【关键词】 乙醇 肝细胞 原代培养 柴胡皂苷-d 保护作用 机制
随着人们生活水平的提高和饮酒量的增加,酒精对肝脏的损害日渐突出。了解酒精对肝损伤的机制,筛选有效预防和治疗酒精性肝损伤的药物应用于临床,是亟待解决的重要课题。目前,中药复方对酒精性肝损伤的实验研究和报道比较多,单味制剂报道较少。柴胡皂苷(saikosaponins SS)是中药柴胡的有效成分,根据其化学结构不同可分为柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d等,以柴胡皂苷d(SS-d)药理活性作用最强。整体水平研究表明柴胡皂苷对酒精性肝损伤有预防作用[1]。本文建立体外乙醇损伤肝细胞模型,在细胞水平上进一步研究柴胡有效成分SS-d对乙醇损伤肝细胞的保护作用机制。
1 器材与方法
1.1 药品与试剂 SS-d(纯度98%),昆明长春花科技有限公司提供,临用前以蒸馏水配制;Hanks液高压灭菌,4℃保存;1.0 g·L-1胰蛋白酶,用Hanks液溶解,过滤除菌,调pH 7.2,分装,-30℃保存;基础培养液,RPMI1640培养基10.0 g,用超净水900 ml溶解,5.6%NaHCO3调pH至7.2,定溶到1 000 ml,过滤除菌,临用前每80 ml,加入新生小牛血清20 ml,青霉素100 U·ml-1,链霉素100 μg·ml-1,胰岛素5 μg·ml-1;MTT:SIGMA公司;ALT,MDA,GSH-px测定试剂盒,南京建成生物工程研究所。
1.2 动物 SD大鼠,2~4 d龄乳鼠,雌雄不限,清洁级,承德医学院实验动物管理中心提供。
1.3 仪器 CO2培养箱(Taibai LNA-122D 日本),MD-100半自动生化分析仪(美国Bayer公司),721W微机型分光光度计(上海光学仪器五厂),离心机(TGL.16G 上海)。
1.4 肝细胞分离培养[2]取新生2~4 d大鼠30只,75%乙醇浸洗后断头放血,无菌分离肝脏,去除肝脏外膜及其周围结缔组织,置Hanks液中,灌注冲洗肝脏至灰白色,将肝脏剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的组织块,用Hanks冲洗数次,除去血细胞,加入0.8g·L-1胰蛋白酶10 ml,37℃孵育12 min,加入数滴血清终止消化,用滴管轻吹打成细胞悬液,经200尼龙筛网过滤后用培养液洗2次,1 000 r离心5 min,收集肝细胞,台盼蓝活细胞计数>85%,按1 ×109个·L-1接种于铺有鼠尾胶原的24孔和96孔板中,37℃,5%CO2条件下培养24 h后更换培养液去除血细胞,继续培养72 h后进行分组实验。
1.5 乙醇诱导肝细胞损伤模型的建立将含肝细胞培养液的96孔板,设正常对照组及乙醇25,50,75,100 mmol ·L-14个剂量组,肝细胞悬液与不同浓度乙醇继续培养12 h,取培养液按赖氏法测定ALT活性,MTT法测定肝细胞存活率。
1.6 MTT法选择SS-d的实验浓度 SS-d初浓度为5 mg/L,采用细胞培养液进行稀释,依次为5.0 ,4.0,3.0 ,2.0 ,1.0 ,0.5 mg·L-1。将肝细胞接种于96孔板培养72 h更换培养液,换用SS-d稀释液培养,另设空白对照组,12 h后吸出培养液,各孔加入0.05%MTT200 μL,37℃孵育4 h,去上清液,各孔加入二甲基亚砜200 μl,混匀以溶解被还原的MTT结晶,检测波长为492 nm的光密度值,计算药物不同稀释浓度下细胞的存活率。
1.7 SS-d对乙醇诱导肝细胞损伤的保护作用取培养72 h肝细胞,设乙醇损伤模型组、SS-d(1 .0,2 .0,3.0mg·L-1)3个剂量保护组、正常对照组,每组设8个复孔。模型组和SS-d组加入乙醇100 mmol·L-1,同时SS-d组加入不同浓度的SS-d,正常对照组加不含血清的培养液,继续培养12 h,收集培养上清液检测ALT活性,收集肝细胞检测MDA含量和GSH-px的活性,MTT法测定肝细胞的存活率。
1.8 统计学处理 数据以 表示,用SPSS计算机软件进行统计学分析, 组间比较采用t检验,P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 乙醇对原代培养肝细胞的损伤不同浓度的乙醇作用于肝细胞,对细胞有剂量依赖性的损伤作用,25 mmol·L-1作用不明显,光镜下细胞形态基本正常,随着浓度的增大,肝细胞存活率呈进行性降低,反映肝细胞损伤的酶ALT逐渐升高;镜下观察肝细胞损伤明显,细胞结构不清,核融解和核膜破裂,其中100 mmol ·L-1乙醇作用最明显,我们选择乙醇浓度为100 mmol ·L-1制备肝细胞损伤模型。见表1。表1 不同浓度乙醇对肝细胞ALT水平及细胞存活率的影响 与空白对照组比较#P<0.05,##P<0.01;n=6
2.2 SS-d 实验浓度的选择SS-d不同浓度时细胞存活率见表2,为避免药物浓度过大所致的细胞毒性作用,应选择对细胞生长无明显影响即肝细胞存活率在90%以上的浓度(1.0 ,2.0 ,3.0 mg·L-1)作为实验所用药物浓度。见表2。表2 不同浓度SS-d对肝细胞存活率的影响与空白对照组比较,#P<0.05,##P<0.01;n=6 2.3 SS-d对乙醇损伤肝细胞的保护作用 100 mmol·L-1乙醇作用肝细胞后,肝细胞损伤明显,大量细胞坏死,细胞内ALT释放量明显升高,细胞内MDA含量明显增高,GSH-px活性明显下降;而给予SS-d保护后, 培养液中ALT水平明显降低;肝细胞MDA含量明显降低,GSH-px活性明显升高;并且肝细胞存活率明显升高。具有明显的剂量依赖性(P<0.05,P<0.01)。表明:SS-d能够保护肝细胞、稳定肝细胞膜的结构,其保护作用可能与抗脂质过氧化作用有关。见表3。表3 SS-d对乙醇损伤肝细胞ALT,MDA,GSH-px水平与对照组比较,*P<0.01,与模型组比较#P<0.05,##P<0.01;n=6
3 讨论
大量研究表明,乙醇对肝细胞损伤是通过自由基介导脂质过氧化作用进行的[3~5]。乙醇在肝脏代谢时产生大量自由基,自由基除直接损伤肝细胞外,可引起肝细胞膜发生脂质过氧化反应,使细胞膜和细胞器结构破坏,膜流动性失常,大量肝内酶(ALT,AST)释放入血,并可抑制抗氧化剂谷胱甘肽的合成,减弱抗氧化酶(GSH-px)的抗氧化能力,使肝细胞代谢紊乱,肝功能异常,肝细胞广泛脂肪样和空泡样变性,最终导致细胞肿胀死亡[6]。因此,清除自由基抑制脂质过氧化反应,才能保护肝细胞,恢复肝细胞结构和功能的完整性。
SS是柴胡的主要成分,研究表明,SS对实验性肝损伤具有明显的保护作用[7,8]。但对单体SS-d保肝作用研究报道较少。因此,我们利用乙醇制备体外肝细胞损伤模型,在细胞水平上对SS-d保肝作用机制进行探讨。本研究显示,模型组肝细胞培养液中ALT活性明显升高,肝细胞脂质过氧化反应产物MDA含量增加,GSH-px活性降低,细胞存活率明显下降,表明乙醇可引起肝细胞氧化损伤;给予SS-d保护后,和模型组比较,肝细胞培养液中ALT活性明显较低,MDA含量明显降低,GSH-px活性明显升高,肝细胞存活率亦有明显升高。提示,SS-d对乙醇损伤肝细胞有明显保护作用,其机制可能是:①SS-d能增强机体内抗氧化防御能力,抑制自由基的产生;②稳定肝细胞膜系统,提高膜结构的稳定性,促进肝细胞增殖,防止肝细胞损伤和坏死。
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