益气活血解毒法对溃疡性结肠炎模型大鼠血浆及结肠组织P选择素的影响

【摘要】 【目的】　观察益气活血解毒法对溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠血浆及结肠组织P选择素表达的影响。【方法】 选用SD大鼠，随机分为4组，即正常组、模型组、中药组(灌胃20g·kg-1·d-1剂量的溃结复发方)、西药组(灌胃0266g·kg-1·d-1剂量的畅美混悬液);分别于给药后10、30 d和停药后10 d取材，采用酶联免疫吸附法检测各组血浆P选择素含量，免疫组化法检测结肠组织P选择素的表达。 【结果】模型组各时间段血浆P选择素含量显著升高(均P<005或P<001)，中药组各时间段血浆P选择素含量显著低于模型组(均P<005或P<001)，西药组治疗10d及治疗30d时血浆P选择素含量显著低于模型组(P<005或P<001);模型组各时间段结肠组织P选择素表达显著高于正常组(均P<001)，中药组治疗30d及停药后10d结肠组织P选择素表达显著降低(均P<001)，且停药后10d作用优于西药组(P<005);西药组治疗10d及治疗30d结肠组织P选择素表达显著降低(均P<001)，且治疗10d时作用优于中药组(P<001)。【结论】益气活血解毒法抗UC复发的作用可能与其能有效降低模型大鼠的血浆及结肠组织P选择素水平，阻抑血小板活化有关。　

【关键词】 益气活血解毒法;　结肠炎/中药疗法;　P选择素/血液;　结肠/病理学;　疾病模型，动物;　大鼠

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种以慢性炎症和溃疡形成为主要病理特征的消化道疾病。由于其患病率逐年增加、高复发率、与结肠直肠癌发生关系密切而成为目前研究热点。本研究观察了益气活血解毒法组成的溃结复发方对三硝基苯磺酸(TNBS)诱发的UC模型大鼠血浆及结肠组织P选择素表达的影响，探讨其抗溃疡性结肠炎复发的作用机制。现将结果报道如下。

　　1　材料与方法

　　11　实验动物　清洁级健康雄性SD大鼠，体质量160～200g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(京)20060006。

　　12　主要试剂与仪器　2、4、6三硝基苯磺酸(TNBS)为Sigma公司产品，批号：074K007;水合氯醛购自恒业中远化工有限公司;酶联免疫吸附(ELISA)法试剂盒由美国RB公司进口分装，购自北京百事创新科技有限公司;免疫组化法检测试剂盒购自北京百事创新科技有限公司;LDZ52型离心机由北京医用离心机厂生产;Labsystems Dragon Wellscan MK3全自动多功能酶标仪;Shandon全自动石蜡包埋机;Shandon全自动石蜡切片机;Olympus Vanox显微镜;Nikon显微照相系统;Imagepro Plus 41图像分析系统。

　　13　药物　溃结复发方主要药物组成有炒五灵脂10g、生蒲黄10g、当归10g、赤白芍各10g、焦槟榔10g、煨木香10g、黄连10g、黄柏10g、生黄芪30g、连翘20g、炒白术10g，均购自北京中医药大学东直门医院，由北京中医药大学东直门医院制剂室煎制，灌胃剂量为体质量60kg成人药量的8倍;奥沙拉秦钠胶囊剂(畅美)由天津力生制药有限公司生产， 灌胃剂量为体质量60kg成人药量的8倍。

　　14　动物模型复制[1-2]　将大鼠正常饲养1周后，禁食24h(不禁水)，称体质量，100mg/L水合氯醛(38mL/kg)腹腔麻醉，将一直径2mm、长约12cm的橡胶管由大鼠肛门轻缓插入，约深8～10cm，然后以085mL TNBS/乙醇液(120mg/kg TNBS+体积分数50%乙醇025mL)，约5s灌注完毕;将造模鼠倒置8min后(尽量减少造模试剂流出)放回笼内。

　　15　动物分组及给药　将120只大鼠随机分为4组，其中模型组、西药组、中药组每组各30只，均予造模;正常组30只，不予造模，但与其他3组同步禁食、麻醉，同步饲养观察。于造模后第2天起正常组、模型组以蒸馏水灌胃，每次1mL/只;西药组以畅美混悬液按0266g·kg-1·d-1剂量灌胃给药;中药组以溃结复发方按20g·kg-1·d-1剂量灌胃给药，均每天1次，共40d。

　　16　取材　分别于给药后10、30d和停药后10d，各组随机取10只大鼠，以100mg/L水合氯醛(38mL/kg)腹腔麻醉，腹主动脉取血，20g/L 乙二胺四乙酸二钠盐及7g/L氯化钠抗凝，立即分离血浆，放-70℃冰箱保存待检。1∶50新洁尔灭溶液浸泡过的镊子及剪刀剪取肛门以上2～10cm结肠组织约1cm，沿着纵轴剖开结肠，生理盐水洗去肠内容物，放入体积分数20%甲醛溶液中固定保存，常规石蜡包埋。

　　17　血浆及结肠组织P选择素表达测定　血浆P选择素含量测定采用ELISA法，结肠组织P选择素表达采用免疫组化法检测，均按试剂盒说明书操作。显微镜下观察以结肠血管内皮细胞膜上出现棕黄色染色为阳性。然后选取切片右上、右下、左上、左下和中间5个典型视野拍摄。运用自动图像分析仪检测每个高倍视野内阳性光密度平均值。

　　18　统计学方法　统计软件采用SPSS 130 for Windows。组间比较用单因素方差分析，多个样本均数比较用重复测量数据的方差分析，采用LSD检验方法。2　结果

　　21　各组大鼠血浆P选择素含量的比较　表1结果显示，模型组造模10d时，P选择素含量显著高于正常组(P<001);造模30d及40d时仍高于正常组(P<005);中药组各时间段P选择素含量均显著低于模型组(P<005或P<001);西药组治疗10d、30d时P选择素含量均显著低于模型组(P<005或P<001)。

　　22　各组结肠组织P选择素表达比较　各组大鼠结肠组织P选择素表达差异见表2、图1~图3(彩图页第516页)。表2结果显示，模型组各时间段结肠组织P选择素表达显著高于正常组(均P<001);　　表1　各组大鼠血浆P选择素含量的比较表2　各组UC模型大鼠结肠组织P选择素表达的比较① P<001，与正常组比较;②P<005，与西药组比较;③P<001，与模型组比较

　　治疗30d及停药后10d中药组结肠组织P选择素表达显著降低(均P<001)。且停药后10d作用优于西药组(P <005);西药组治疗10d 及治疗30d P选择素表达显著降低(均P<001);且治疗10d时作用优于中药组(P<005)。

　　3　讨论

　　静止的血小板及内皮细胞表面不表达P选择素，当组织发生炎症或受其他损伤时，血小板的α颗粒和内皮细胞WeibelPalade小体迅速与质膜融合而使P选择素在血小板和内皮细胞的表面表达，P选择素是反映血小板活化程度的特异性标志物[3]。研究认为在UC 患者血中因血小板活化而形成大量血小板—白细胞聚集体，进而参与血栓并发症的形成[4];血栓形成后可阻塞血管，加重肠黏膜的缺血、缺氧，并进一步损伤肠黏膜，导致本病反复发作、迁延不愈。

　　本实验在造模第10天时模型组血浆及结肠组织中P选择素水平均显著高于正常组，之后逐渐下降，造模第40天时仍明显高于正常组，提示造模10d时是模型炎症的急性期，血小板和内皮细胞活化，介导炎性细胞粘附、聚集，参与急性炎症反应;随着病程进入中期(造模30d)和缓解期(造模第40天)，模型组P选择素水平逐渐下降但并未恢复正常，说明在中期和缓解期仍存在血小板活化。

　　本实验结果表明，急性炎症反应阶段，中药与西药均有下调P选择素水平的作用，西药作用明显优于中药，在此阶段，中西药物均能通过有效抑制血小板和内皮细胞的活化来抑制炎症反应，从而缓解模型大鼠的临床症状;在中期，中药下调作用更显著，并将P选择素降至正常水平以下，西药作用减弱，在缓解期，中药的后续作用仍能将P选择素水平维持在正常以下，而西药组P选择素水平与模型组比较无显著差异;中药在抑制血小板及内皮细胞活化从而抑制炎症反应方面较西药起效慢，但维持时间却比西药长，远期效果优于西药，从而在改善微循环、减少血栓形成方面发挥作用，减少UC的复发。因此，益气活血解毒法抗UC复发的作用可能与其能有效降低模型大鼠的血浆及结肠组织P选择素水平，阻抑血小板活化有关。

【参考文献】
　　[1]张涛，谢建群大鼠溃疡性结肠炎模型的实验研究[J]中国中西医结合消化杂志，2006，14(4):240

　　[2]宫健伟，苑述刚，阮时宝对免疫方法制作溃疡性结肠炎动物模型的探讨[J]中国实验方剂学杂志，2005，11(2):70

　　[3]刘宁，吕晶P选择素与血小板活化[J]国外医学：生理病理科学与临床分册，2003，23(2):173

　　[4] Irvingp M， Maceym G， Shah U， et al Formation of plateletleukocyte aggregates in inflammatory bowel disease[J] Inflamm Bowel Dis ， 2004，10:361