线粒体损伤的检测方法研究进展

线粒体损伤的检测方法研究进展

刘全李毅

（青海大学附属医院烧伤整形科；青海西宁810000）

摘要：线粒体是细胞能量代谢的中心，而在各种致病因素作用下线粒体极易出现各种结构和功能损伤，这在疾病的发生与发展中起着十分重要的影响，文章就线粒体结构和功能损伤及其检测方法作一综述。

关键词：线粒体损伤；检测方法

线粒体位于细胞核外,既能产生能量又能携带遗传信息,它在生物的生长、发育、代谢、衰老、疾病、死亡以及生物进化等方面都有非常重要的意义。而在外界各种致病因素作用下线粒体极易出现损伤,造成线粒体功能的障碍,进一步导致细胞功能的损伤,引起细胞的自噬、凋亡。这在疾病的发生与发展中起着十分重要的影响，因此寻找特异、敏感的线粒体损伤指标，检测可能的早期损伤，对于机体有着十分重要的意义。

线粒体损伤的基本机制包括线粒体DNA(mtDNA)的损伤和线粒体膜损伤。氧化应激的激活,产生过多的氧自由基,除了引起碱基配对错误、碱基位点的修饰和链的断裂使mtDNA损伤外,还使细胞及线粒体膜脂质过氧化,导致线粒体功能障碍,ATP生成减少,钙泵失活使细胞内钙增多,激活磷脂酶活性,使膜磷脂分解,造成膜通透性改变和跨膜电位的变化,导致蛋白质的释放并造成线粒体自身以及细胞的功能障碍,细胞色素C从线粒体释放到细胞浆,导致细胞凋亡或死亡。

线粒体损伤检测方法:

(1)线粒体形态学变化检测方法：20世纪60年代初，Engel等[1]首先用MGT染色发现线粒体肌病患者肌膜和肌纤维之间呈不规则的红染颗粒改变，称为粗糙红纤维，为线粒体肌病具有特征性的形态学改变。宋东林等[2]曾用电镜观察线粒体肌病时发现在骨骼肌肌膜下线粒体异常增多，并有巨大畸形线粒体出现，线粒体嵴型异常，可呈同心漩涡状、迷宫状或矩形结晶状结构。姚英民等[3]曾用电镜观察轮状病毒感染时线粒体形态变化时发现线粒体外形肿胀，电子密度增高，基质中在大量具有紊乱的峭和晶状物，峭模糊不清，基质凝集。此外还可以采用分光光度法和钙离子荧光探针FLUO-2/AM及荧光分光光度法测定线粒体肿胀及游离钙离子的含量。

(2)mtDNA缺失突变的检测方法:实时荧光PCR技术是目前最准确、重现性最好并得到国际公认的核酸分子定量检测的标准方法。它是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量。该技术具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、无污染、自动化程度高、能实现多重反应、具实时性和准确性等优点，适于快速分析要求的大样本。进行mtDNA缺失片段和对照DNA片段的定量分析时，一般采用相对定量，最后计算出发生缺失的mtDNA占总mtDNA的比例。常用的检测模式有TaqMan探针和SYBRGreenI检测模式。

(3)线粒体渗透转换孔（mitochondrialpermeablitytransitionpore,MPTP)）[4]是线粒体渗透转换功能的结构基础，MPTP对细胞内多种离子浓度变化非常敏感[5]，特别是对Ca2+浓度变化敏感。MPTP的大量开启能引起膜电位的崩解并导致包括细胞的凋亡。因此测定MPTP在线粒体的研究中至关重要。有关对MPTP的检测方法有：活性物质标记测定、膜片钳法等[6]。标记法需要对物质进行标记且测定繁琐，需要特殊的检测方法；膜片钳法需要特殊的电极，工艺复杂，需要较高的技术；分光光度法简单易用，只需对反应体系的吸光度进行时间扫描，就可获得线粒体渗透转换能力的时相变化，间接反映了MPTP的能力.

(4)膜电位的检测方法:Chu等[7]刮曾用激光共聚焦检测大鼠肠黏膜细胞线粒体跨膜电位变化，该法采用线粒体跨膜电位检测试剂盒JC-1。JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位Δψm的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡鼍线粒体去极化的比例。Lim等[8]用四苯膦等脂溶性阳离子渗透入线粒体膜基质，然后通过检测四苯膦的浓度来确定膜电位，需要注意的是此法在检测过程中对溶液pH值的稳定性要求较高，否则将影响实测值。膜片钳技术是一种以记录通过细胞膜上的各种离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一或多个离子通道活动的技术，其反映的电流特征可以用来评价线粒体功能。全自动膜片钳技术效率高，是传统膜片钳技术的20～300倍，操作技术简单；缺点是仅适用于悬浮细胞的检测[9]。线粒体膜是线粒体与周围环境联系、反应的桥梁，膜磷脂含量与流动性的改变与疾病的发生、发展密切相关。脂质过氧化作用可以导致膜磷脂的减少，线粒体膜磷脂的检测对判断线粒体功能具有重要意义[10]。

(5)胞内活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）可破坏线粒体的酶类、脂类和核酸，使机体出现氧化应激，进入恶性循环状态。同时ROS还可攻击线粒体DNA产生氧化损伤，导致线粒体ATP合成减少、线粒体膜电位破坏等结构和功能变化，因此ROS增多也是线粒体功能障碍的表现之一[11，12]。ROS可采用荧光探针DCHFDA染料测定；用荧光探针MitoSOX检测线粒体活性氧。胞内ROS测定还包括化学发光法、电子自旋共振和分光光度法。

总结与展望

综上所述，线粒体是细胞能量的主要来源，对维持细胞正常生理功能起着重要作用。线粒体功能的改变往往先于临床症状出现。对线粒体结构及功能的检测可以及时察觉细胞功能的改变并做相应的处理，可以阻止或延缓疾病的发生、发展。虽然现在有多种方法可以用来检测线粒体的功能，但是由于多方面条件的限制，目前绝大多数方法仅局限于科研，距离真正的临床实际应用仍然有很长的路要走。

参考文献

[1]EngelWK,CunninghamGG.RAPIDEXAMINATIONOFMUSCLETISSUE.ANIMPROVEDTRICHROMEMETHODFORFRESH-FROZENBIOPSYSECTIONS[J].Neurology,1963,13(13):919-923

[2]宋东林,吕强,陈晋文,等.线粒体肌病和线粒体脑肌病组织化学及电镜的研究[J].中国神经精神疾病杂志,1994(1):143-145.

[3]姚英民,欧巧群,陈瑶.人类轮状病毒感染新生小鼠肠道外组织超微结构的变化[J].南方医科大学学报,2006,26(9):1334-1336.

[4]ZorattiM.SzaboI.Themitochondrialpermeabilitytransition[J]BiochimBiophysActa,1995,141:139—176.

[5]ScorranoL,PetronilliV,BernardiP.Onthevoltagedependenceofthemitochondrialpermeabilitytransitionpore.Acriticalappraisal.[J].JBioChem,1997,272(19):12295.

[6]PastorinoJG,SimbulaG,GilforE,etal.ProtoporphyrinIX,anendogenousligandoftheperipheralbenzodiazepinereceptor,potentiatesinductionofthemitochondrialpermeabilitytransitionandthekillingofculturedhepatocytesbyrotenone[J].JBioChem,,1994,269(49):31041-6.

[7]ChuWW,NieL,HeXY,etal.[Changeofcytochromecinpostconditioningattenuatingischemia-reperfusion-inducedmucosalapoptosisinratintestine].[J].ShengLIXueBao,2010,62(2):143-148.

[8]LimTS,DávilaA,WallaceDC,etal.Assessmentofmitochondrialmembranepotentialusinganon-chipmicroelectrodeinamicrofluidicdevice[J].LabonAChip,2010,10(13):1683-1688

[9]曹小于,郑婉云,鲁燕滨,等.离子通道研究技术的最新进展——全自动膜片钳技术[J].现代仪器与医疗,2007,13(2):47-50.

[10]左钱飞,张海献,鲁鹏飞.线粒体损伤与检测方法研究进展[J].科学之友,2009(17):5-6.

[11]SantosJH,HunakovaL,ChenY,etal.CellsortingexperimentslinkpersistentmitochondrialDNAdamagewithlossofmitochondrialmembranepotentialandapoptoticcelldeath.[J].JournalofBiologicalChemistry,2003,278(3):1728.

[12]HoutenBV,WoshnerV,SantosJH.RoleofmitochondrialDNAintoxicresponsestooxidativestress[J].DnaRepair,2006,5(2):145-152.