下调miR-150表达抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖

下调miR-150表达抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖

张先锋肖娟黄远见

张先锋肖娟黄远见

(南华大学附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科湖南衡阳421001）

【摘要】目的：本研究探讨干扰miR-150表达对鼻咽癌细胞5-8F增殖的影响。方法：使用脂质体将miR-150抑制剂转染5-8F，以无关序列抑制剂作为阴性对照。采用qRT-PCR技术验证miR-150抑制剂转染细胞中miR-150的表达水平；通过MTS法实验观察miR-150表达下调对5-8F细胞增殖能力的影响。结果：转染miR-150抑制剂的5-8F细胞中miR-150的表达量明显下调，并且呈现明显的浓度依赖性。表明转染miR-150抑制剂能显著降低5-8F细胞中miR-150的表达。转染miR-150抑制剂的5-8F细胞与对照细胞相比，增殖速度明显减慢，差异具有显著性（P<0.05）。结论：miR-150能促进鼻咽癌细胞增殖能力，它可能在鼻咽癌的发生和进展中发挥重要作用。

【关键词】鼻咽癌；miR-150；细胞增殖

【中图分类号】R73【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）06-0172-02

miRNA是一类长度为18～24个核苷酸的非编码、内源性小RNA分子，通过靶向结合mRNA的3′非编码区，使翻译抑制或导致mRNA降解，进而调控靶基因表达量[1]。miRNA参与重要生物学进程的调控，包括细胞增殖、凋亡、分化、代谢等过程。肿瘤的发生发展过程涉及多种基因的参与和多种因子的调控。miRNA是重要的调控因子，通过调节相关癌基因或抑癌基因，从而参与多种肿瘤的发生、进展过程[2]。近期，本课题通过qRT-PCR技术检测了miR-150在鼻咽癌细胞系以及放疗抵抗中差异表达，通过转染miR-150抑制剂CNE-2R细胞的放射敏感性得到了提升，而转染miR-150模拟物后CNE-2细胞的抗辐射能力明显增强。本研究通过在鼻咽癌5-8F细胞中转染miR-150抑制剂使miR-150表达下调，探讨miR-150下调对鼻咽癌细胞增殖的影响，从而初步揭示miR-150在鼻咽癌中生物学功能。

1.材料与方法

1.1主要材料

miR-150抑制剂及对照购自Ambion公司。

1.2细胞培养

鼻咽癌细胞株5-8F为典型低分化鳞癌细胞，培养于含10％小牛血清的RPMI1640，在95%湿度，5%CO2，37℃条件下。

1.3细胞转染

用胰蛋白酶对细胞进行消化，将细胞计数并接种在6孔板中，确保在转染当天，70％的细胞汇合。使用Lipofectamine2000（Invitrogen）将浓度均为100nM的miR-150模拟物,miR-150抑制剂以及相应对照物转染至细胞。在转染36小时后，进行后续的实验。

1.4qRT-PCR检测

取适量细胞，提取用试剂盒(OMEGABio-Tek)提取纯化miRNA，并利用miScriptIIRTKit(QIAGEN)逆转录合成cDNA。按照SYBRGreenPCR试剂盒（QIAGEN）说明书进行Real-timePCR。研究miR-150含量时，选取RUN6作为内参。提取总RNA，实验独立重复三次。

1.5MTS法检测细胞增殖活性

采用MTS法检测细胞增殖，根据CellTiter96?AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒（Promega公司）说明书方法对细胞增殖进行检测。

2.结果

2.1转染miRNA-21抑制剂细胞内miRNA-21表达变化

分别用无关序列抑制剂及miR-150抑制剂（终浓度为10μM/L、20μM/L、40μM/L）转染5-8F细胞，48小时后抽提细胞总RNA，运用qRT-PCR验证miR-150在细胞中的表达。结果表明，转染不同浓度miR-150抑制剂的细胞中miR-150的表达量明显下调，并且呈现明显的浓度依赖性。表明转染miR-150抑制剂能显著降低5-8F细胞中miR-150的表达。

2.2miR-150下调后5-8F细胞增殖速度减慢

通过MTS法检测，绘制生长曲线来考察miR-150下调对鼻咽癌细胞5-8F增殖的影响。结果发现，转染不同浓度miR-150抑制剂的5-8F细胞从第48h起增殖速度明显减慢。统计分析各组在96h时的细胞增殖情况发现，不同浓度miR-150inhibito组与对照细胞组相比，差异均有统计学意义（P<0.05），并且呈现明显的浓度依赖性。

3.讨论

MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性的短的保守的非编码RNA，它们通过特异的与mRNA的3'UTR(3'端非翻译区)结合使之降解或者抑制其翻译，从而调控相关靶基因的表达[3]。miRNA在许多人类癌症中发挥着原癌基因或肿瘤抑制基因的作用。一些miRNA已被证实与鼻咽癌的发生，发展，侵袭和转移密切相关，如miR-141，miR-218[4]。然而，miRNA在鼻咽癌辐射抵抗中所发挥的作用至今鲜有报道。已有文献报道miR-150促进一些肿瘤的发生发展。例如，miR-150通过靶向胃癌组织中促凋亡基因EGR2发挥促癌作用[5]同时在一些上皮来源的恶性肿瘤中miR-150可靶向促凋亡的嘌呤能P2X7受体发挥癌基因作用。然而miR-150在鼻咽癌发生发展中的作用目前并不清楚。通过本次研究，我们通过MTS实验将miR-150抑制剂转染至鼻咽癌细胞5-8F细胞中，观察miR-150下调对细胞增殖能力的影响。结果发现转染miR-150抑制剂的5-8F细胞从48h起增殖速度明显减慢。我们的结果与文献报道的一致，即miR-150能促进鼻咽癌增殖和侵袭能力，很可能作为一个癌基因参与鼻咽癌的发生与进展。miR-150能正调控鼻咽癌增殖和侵袭能力，因而它有可能成为鼻咽癌治疗的潜在靶点。

【参考文献】

[1]ChenPS,SuJL,HungMC.DysregulationofMicroRNAsincancer[J].JBiomedSci.2012;19(1):90.

[2]LiuJ,ZhengM,TangYL,etal.MicroRNAs,anactiveandversatilegroupincancers[J].IntJOralSci,2011,3(4):165-175.

[3]Davis-DusenberyBNandHataA:MicroRNAinCancer:TheInvolvementofAberrantMicroRNABiogenesisRegulatoryPathways[J].GenesCancer,2010,1(11):1100-1114.

[4]ZhangL,DengT,LiX,etal.microRNA-141isinvolvedinanasopharyngealcarcinoma-relatedgenesnetwork[J].Carcinogenesis,2010,31(4):559-566.

[5]WuQ,JinH,YangZ,etal.MiR-150promotesgastriccancerproliferationbynegativelyregulatingthepro-apoptoticgeneEGR2[J].BiochemBiophysResCommun,2010,392(3):340-345.

基金资助：湖南省科技厅项目资助（2014SK3081）