人胎儿来源与母体来源胎盘间充质细胞的获得与鉴定

人胎儿来源与母体来源胎盘间充质细胞的获得与鉴定

刘婷朱永朝王立斌马晓娜李玉奎魏军

刘婷朱永朝王立斌马晓娜李玉奎魏军（宁夏医科大学附属医院宁夏人类干细胞研究所750004）

【中图分类号】R329【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2010)35-0116-02

【摘要】目的分别从人胎盘组织中获得胎儿来源与母体来源的间充质细胞，并对得到的细胞进行鉴定。方法分离纯化胎儿侧与母体侧的胎盘间充质细胞,体外扩增后进行细胞形态学比较以及PCR扩增方法鉴定细胞与胎儿和产妇本人的免疫配型。结果成功从人胎盘中获得了分别与胎儿和产妇本人免疫配型相合的胎儿来源胎盘间充质细胞和母体来源胎盘间充质细胞。结论本研究成功从胎盘组织中获得了胎儿来源和母体来源胎盘间充质细胞，均可以作为临床干细胞治疗的种子细胞。

【关键词】胎盘间充质细胞母体来源胎儿来源免疫分型

近年来的研究发现，胎盘中含有丰富的繁殖力极强的间充质细胞[1]，并且胎盘间充质细胞组织发育上更早期，免疫原性更弱，用来进行异体移植发生免疫排斥的可能性更低[2-6]。因而可能成为组织修复和基因治疗的新细胞来源。

本研究成功从人胎盘中获得了分别与胎儿和产妇本人免疫配型相合的胎儿来源胎盘间充质细胞（PMSCs）和母体来源胎盘间充质细胞（MPMSCs），并进行了相应的鉴定，为胎盘间充质干细胞的深入研究，以及应用于临床提供了一定的实验基础。

一、材料与方法

1.实验材料

人足月胎盘组织样本与人外周血标本经本人签署知情同意书后，取自宁夏医科大学附属医院。

2.实验试剂

2.1常用试剂胎牛血清(FBS)、DispaseⅡ、CollagenaseIV购自Gibco公司，L-DMEM、Antibiotic、L-谷氨酰胺购自Invitrogen公司，基因组DNA提取试剂盒购自OMEGA公司，引物合成自上海生工。

2.2间充质细胞培养液含10%FBS，1%L-谷氨酰胺，1%Antibiotic的L-DMEM。

3.实验方法

3.1胎盘间充质细胞的获得分别从胎盘胎儿侧和母体侧剪取1-2cm厚的组织，剪成1m3的组织块，加入240U/mLDispaseⅡ和270U/mLCollagenaseIV在37℃水浴消化1hr后，吸取中间细胞悬液经200目滤网过滤后，以5X106/ml密度接种于细胞培养瓶中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。

3.2胎盘间充质细胞的长期传代培养待细胞生长至70%-80%融合时，以1：3的比例传代。重复上述操作，反复传代扩增，逐步淘汰其它细胞，从而得到较均一的间充质细胞。

3.3胎盘间充质细胞形态学观察分别取不同代次PMSCs、MPMSCs细胞于倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化。

3.4筛选适合宁夏地区的短串联重复序列(STR)基因座设计STR基因座引物：GATA198B05上游引物5'-GTGGAGCCAATTCACCTAAT-3'，下游引物5'-GAGAGACAGAACCTATAGCATGC-3'；D10S2325上游引物5'-CTCACGAAAGAAGCCTTCTG-3'，下游引物5'-GAGCTGAGAGATCACGCACT-3'；D18S535上游引物5'-TCATGTGACAAAAGCCAAC-3'，下游引物5'-AGACAGAAATATAGATGAGAATGCA-3'；D2S1399上游引物5'-CATTGGTCCAGGTAAACTGC-3'，下游引物5'-TTCACAAGGTTCCACAAGGT-3'。为了验证这四个个位点的多态性，我们随机抽取宁夏地区无亲缘关系的10人外周血DNA，用以上四对引物进行PCR扩增，产物行10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。

3.5PCR扩增方法鉴定细胞的免疫配型提取同一份胎盘标本PMSCs和MPMSCs细胞全基因组DNA，与抽取的该份胎盘父母双方外周血的全基因组DNA，分别进行上述四个STR基因座的PCR扩增。

二、实验结果

1.胎盘组织形态的观察胎儿侧胎盘组织表面分布着丰富的血管与结缔组织，颜色呈浅红色，触感较硬；母体侧胎盘组织较为松软，颜色呈暗红色。

2.胎盘间充质细胞的培养与观察从同一份胎盘标本中分别获得的PMSCs、MPMSCs细胞形态上未见明显差异，都呈梭形涡旋状生长，增殖速度较快。本实验室条件下原代培养两种细胞均连续传至第15代仍可保持干细胞特性（图1）。

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图1：人胎儿侧与母体侧胎盘间充质细胞分离培养

A：PMSCs原代细胞图（200X）；B：MPMSCs原代细胞图（200X）；C：PMSCs第五代细胞图（200X）；D：MPMSCs第五代细胞图（200X）。A、B均有未完全消化的组织块存在，细胞形态不均一；C、D细胞呈梭形，形态较为均一，细胞呈典型涡旋状生长。

3.适合宁夏地区的STR基因座筛选验证电泳结果显示，随机抽取测定的宁夏地区无亲缘关系的10人四个STR基因座等位基因互不相同，说明这四个STR基因座在宁夏地区存在丰富的多态性，满足本研究需要（图2）。

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图2：STR基因座多态性Native-PAGE验证结果

各图中的10个泳道分别为随机抽取的10个不同个体在同一基因座上表现出的不同的等位基因。A：GATA198B05基因座；B：D10S2325基因座；C：D18S535基因座；D:D2S1399基因座。

4.胎儿来源与母体来源胎盘间充质细胞的免疫配型PCR结果表明，分离获得的PMSCs与父母在同一基因座上分别有一条等位基因是完全相同的，而MPMSCs与母亲本人外周血标本测得的等位基因完全一致（图3），说明我们成功获得了与胎儿免疫配型一致的胎儿来源胎盘间充质细胞，以及与产妇本人免疫配型一致的母体来

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图3：STR分型鉴定胎盘间充质细胞来源

A：1-4泳道分别为母亲外周血，MPMSCs，PMSCs以及父亲外周血DNA，引物为D2S1399；5-8泳道分别为母亲外周血，MPMSCs，PMSCs以及父亲外周血DNA，引物为D10S2325；B：1-4泳道分别为母亲外周血，MPMSCs，PMSCs以及父亲外周血DNA，引物为D18S535；5-8泳道分别为母亲外周血，MPMSCs，PMSCs以及父亲外周血DNA，引物为GATA198B05。

三、讨论

胎盘作为胚胎发育中维系母体和胎儿氧气及营养物质交换的重要暂时性器官，是一种由起源于细胞滋养层和胚外中胚层的胎儿组织与母体子宫基蜕膜组织共同组成的器官。

本研究成功从人胎盘组织中分离出胎儿侧和母体侧间充质细胞，在传代培养中未发现两种细胞间存在明显差异，通过STR分型技术，对细胞进行了免疫分型，证明了从胎盘中可以分别获得与胎儿免疫配型一致的胎儿来源胎盘间充质细胞，以及与产妇本人免疫配型一致的母体来源胎盘间充质细胞。

目前,世界上有上亿的不同疾病的患者有待细胞或器官移植治疗,并且这一数字正在快速增长。例如，据世界卫生组织统计，我国每年约有400多万名患者等待着造血干细胞的移植，而且仅白血病患者每年就新增4万多人。这些数字表明，找到新的组织修复和基因治疗的细胞来源十分紧迫。本研究结果为充分利用胎盘间充质细胞，扩大临床可用的细胞来源提供了新的思路。

参考文献

[1]KavianiA,PerryTE,etal.Theplacentaasacellsourceinfetaltissueengineering.JPediatricSurg,2002,37:995-999.

[2]KadiyalaS,YoungRG,ThideMA,etal.Cultureexpandedcaninemesenchymalstemcellspossessosteochondrogenicpotentialinvivoandinvitro.CellTransplant,1997,6(2):125-134.

[3]YenBL,HuangHI,ChienCC,etal.Isolationofmultipotentcellsfromhumantermplacenta.StemCells,2005,23(1):3-9.

[4]BailoM,SonciniM,VertuaE,etal.Engraftmentpotentialofhumanamnionandchorioncellsderivedfromtermplacenta.Transplantation,2004,78(10):1439-1448.

[5]PeisterA,MelladJA,LarsonBL,etal.Adultstemcellsfrombonemarrow(MSCs)isolatedfromdifferentstrainsofinbredmicevaryinsurfaceepitopes,ratesofproliferation,anddifferentiationpotential.Blood,2004,103(5):1662-1668.

[6]MusinaRA,BekchanovaES,BelyavskiiAV,etal.Differentiationpotentialofmesenchymalstemcellsofdifferentorigin.BullExpBiolMed,2006,141(1):147-151.