雌激素对氧诱导新生大鼠视网膜病变作用机制的实验研究

雌激素对氧诱导新生大鼠视网膜病变作用机制的实验研究

李志萍陈惠军王庆九

李志萍陈惠军王庆九(新乡市中心医院453000)

【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）28-0031-02

【摘要】目的通过氧诱导视网膜病变模型模拟早产儿视网膜病变，予腹腔内注射雌二醇，探讨雌二醇对大鼠氧诱导视网膜病变的作用机制。方法建立氧诱导视网膜病变模型，新生wistar大鼠60只随机分为正常对照组，高氧模型组，治疗组（治疗组生后即腹腔内注射雌二醇1ug），用免疫组织化学染色检测视网膜组织中血管内皮生长因子含量的变化。结果免疫组织化学染色：血管内皮生长因子在对照组的视网膜组织中有一定表达，高氧组其表达水平升高，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01），治疗组血管内皮生长因子表达量286.2221±3.552，正常对照组，高氧模型组，药物治疗组各组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。结论血管内皮生长因子在氧诱导视网膜病变大鼠模型中表达增强，雌二醇通过减少血管内皮生长因子的表达，预防和抑制视网膜血管增生。

【关键词】雌二醇大鼠视网膜病变血管内皮生长因子

早产儿视网膜病(Retinopathyofprematurity,ROP)是一种视网膜血管异常增殖的病变,已成为儿童致盲的主要原因[1]，约占儿童致盲的6％～18％[2]，目前ROP的发病机制及关键因子尚未完全发现,血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)被认为是重要的血管生长因子[3]，VEGF成为预防和治疗ROP的靶点。本课题旨在建立动物视网膜病变模型，采用SABC，ELISA等方法手段，分析其发病机制。

一、方法

选择新生健康Wister大鼠60只，性别不限，系清洁动物，随机分为3组：对照组，高氧模型组，治疗组，对照组置于正常空气中饲养，治疗组高氧组氧流量3-4L/分，氮流量控制在0.5-1L。使容器内氧浓度在75%左右，5天后回到正常空气中饲养，治疗组腹腔内注射雌二醇1ug（美国sigma公司生产，共用10天），新生鼠在第10天各组取15只新生鼠，行颈椎脱臼处死后摘取双眼，用于石蜡包埋。病理切片：取眼球置于4%多聚甲醛溶液固定24小时，梯度酒精脱水、二甲苯透明，石蜡包埋；连续切片，厚度4um，切片方向平行于角膜至视乳头的矢状位平面；免疫组织化学SABC法：脱蜡，水化切片，预处理组织切片，微波修复：蒸馏水漂洗，加一抗VEGF抗体浓度1:50，PBS漂洗3次，镜下DAB染色，蒸馏水漂洗，苏木素复染，封片，设立阴性对照，在相应的组织切片免疫组化过程中，以PBS代替一抗，其余条件不变。ELISA检测VEGF：测出各孔OD值，样本品浓度已知，我们利用标本品的OD值及其相对应的浓度，以OD值为横坐标，浓度为纵坐标，做一条标准曲线，根据样本的OD值计算VEGF浓度。

统计学处理：实验室数据资料以-x±S表示，所有数据均以SPSS11.5统计学软件进行多个样本均数的单因素方差分析及组间q检验，以P<0.05作为差别有统计学意义，P<0.01作为差别有高度统计学意义。

二、结果

免疫组织化学染色：

对照组：VEGF表达较弱，主要表达在内核层和神经纤维层细胞质内，成淡黄色(图1);高氧模型组：视网膜内VEGF各层均有表达，主要位于神经纤维层和新生血管内皮，呈棕褐色，表达强：可见突破内界膜和视网膜内界膜处可见新生血管(图2)；治疗组：视网膜内VEGF各层均有表达，主要位于神经纤维层，内界膜和新生血管内皮细胞，呈棕色（图3）。

ELISA测定结果：

ELISA试剂盒标准品浓度为1000,500,250,100,50,0经酶标测试后得数值为0.678,0.825,1.232,1.468,1.892,根据上述数值得出ELISA标准曲线，将大鼠在酶标义上测得的OD值换算为VEGF的浓度，如下：

高氧组与对照组比较P<0.01，高氧组与治疗组比较P<0.01

由结果得出：正常大鼠视网膜内有少量VEGF的表达，而高氧组VEGF表达增高，治疗组VEGF表达较对照组高，较高氧组低。

三、讨论

目前ROP的发病机制尚不完全清楚，研究认为[4～8]ROP发病的主要内因是早产及视网膜血管发育尚未成熟，在血管进一步成熟过程中，由于代谢需求增加导致局部视网膜缺氧；外因主要是长时间高浓度吸氧，使未发育成熟的视网膜血管收缩、阻塞，而且使正常视网膜血管发育停止，导致视网膜缺氧。视网膜缺氧可继发血管内皮生长因子大量产生，从而刺激新生血管形成，最终导致ROP。

目前国内外学者将研究焦点集中在视网膜新生血管的形成和调控，研究表明新生血管形成是许多促进血管生长的因子和抑制血管生长的因子相互变化和共同作用的结果。在促进血管生长的因子中，VEGF是启动新生血管形成所必需的最重要物质VEGF可引起血管内皮细胞的收缩，导致血管通透性的增加，引起细胞及血管外基质成分改变刺激基质细胞的增生，有利于新生血管的形成。本实验证实高氧诱导的大鼠视网膜病变中VEGF呈现高表达，且VEGF的高表达与视网膜新生血管成正相关。但在人类ROP时血清VEGF浓度又是如何变化的，需进一步研究。雌激素是类固醇类激素，主要由卵巢分泌产生，包括雌二醇、雌三醇及孕酮，以雌二醇作用最强，17β一雌二醇不仅作用于性器官，而且也作用于中枢神经、骨组织，心血管系统及眼组织。ZhiX等[9]用免疫组织化学方法观察到了雌二醇能够抑制了VEGF的表达。Ruohola等发现雌激素拮抗剂能够增加VEGF的表达，诱导新生血管生成。本课题成功建立高氧诱导大鼠视网膜病病变基础上，给予腹腔内注射雌二醇，利用免疫组化和ELISA实验检测视网膜组织中VEGF的含量变化。结果显示：高氧诱导大鼠视网膜病变模型中视网膜组织VEGF的表达增加，给予雌二醇治疗后对高氧模型组中视网膜组织表达VEGF的上调有抑制作用，视网膜新生血管密度降低，表明雌二醇通过下调VEGF的表达起到预防和治疗作用的。雌二醇治疗早产儿视网膜病尚未应用于临床，在ROP的不同阶段中，血清雌二醇浓度究竟是如何变化的,目前尚不清楚，有待于进一步研究。

早产儿视网膜病变防治的关键是早发现和及时治疗，对ROP治疗主要采取激光或手术治疗,损伤大效果不理想,寻找有效的药物来防治成为ROP研究热点。本课题研究中证实雌激素在ROP的发病过程中起着重要作用，虽不能完全避免ROP的发生，但可减轻ROP的病情，但药物最终应用于临床，还需要大量的临床研究和随访，以确定其用药剂量、用药方法、给药时间，评估其疗效、安全性、副作用。

参考文献

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