结直肠癌患者血清miR-92a水平测定的临床意义

结直肠癌患者血清miR-92a水平测定的临床意义

吴兵1庞智2沙莎1徐峰2尹少朋2

吴兵1庞智2（通讯作者）沙莎1徐峰2尹少朋2

（1苏州市吴中人民医院消化内科江苏苏州215128）

（2苏州市立医院北区消化内科江苏苏州215008）

【摘要】目的结直肠癌（CRC）仍然是全球性癌症和癌症相关性死亡的主要类型之一。临床上正在致力于寻找能早期诊断CRC的非侵入性的敏感生物标志物，以帮助CRC患者获得最佳治疗方案和提高其生存率。微小RNA（miRNAs）最近被确定为重要的肿瘤调节因子，可能代表新型的癌症生物标志物。本研究的目的是探讨血清miR-92a在CRC诊断和预后判断中的价值。方法选取结直肠癌患者98例,包括存在肝转移的患者48例，同时募集50名健康志愿者为对照组，按类似的年龄和性别相匹配的队列组合。应用实时荧光定量PCR法检测miR-92a水平。分析miR-92a表达与结直肠癌患者临床参数之间的相关性，判断血清miR-92a在结直肠癌早期诊断和预后判断中的价值。结果结直肠癌患者的血清miR-92a水平显著高于健康对照者，血清miR-92a相对定量值(临界值为0.165)进行结直肠癌诊断时的灵敏度为75.26％，特异度为88.32％，该生物标志物可产生最大受试者工作特征曲线的曲线下面积(AUC)为0.863；miR-92a的AUC>0.7，与AUC=0.5比较，差异有统计学意义(P<0.05)，结直肠癌肝转移的患者血清miR-92a水平显著高于未转移的CRC患者（P<0.05）。该生物标志物的AUC为0.896。在临界值为0.173时，鉴别转移性与非转移性CRC患者的敏感性为78.56％，特异性为86.59％。结论血清miR-92a可能是一种新的非侵入性指标用于结直肠癌患者的早期诊断，血清中的miR-92a水平升高与结直肠癌患者预后有关，该新的非侵入性生物标志物有望成为结直肠癌筛查和早期诊断和预后判断的指标。

【关键词】结直肠癌血清微小RNA生物学标记诊断

【中图分类号】R730【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）34-0058-02

微小RNA(microRNA，miRNA)是动植物体内长度约21～25个核苷酸的非编码RNA分子，主要通过切断降解和抑制翻译对靶基因进行负调控[1]。miRNA作为人类肿瘤信号通路积极的参与者，不仅扮演着原癌基因和抑癌基因的角色，而且与肿瘤的转移、凋亡有关。由于不同肿瘤有着各自特异性的miRNA表达谱，且miRNA在用甲醛固定的组织中有较高的稳定性，所以越来越多的科学家提出miRNA在血清和血浆中也可能有稳定的表达，并可以作为潜在的新型肿瘤标志物。研究结果显示，检测miRNA的特异性表达不仅有助于肿瘤的早期诊断，还可用于患者的预后判断。这些研究充分证实，血清及血浆miRNA的测定是一个检测癌症生物学标志物很有前途的领域。

结直肠癌是临床上最常见的三大恶性肿瘤之一,也是世界上癌症相关死亡的主要原因[1]。结直肠癌是个多阶段、多步骤的病变过程,是由良性腺瘤向恶性腺癌和癌远处转移的演变过程,使筛查和早期诊断对于及时发现结直肠癌,减少患病率成为理想的选择,这迫切需要开发新的筛查工具和诊断性生物标志物。本研究的目的是本研究应用实时荧光定量PCR技术检测结直肠癌患者血清微小RNA(miR-92a)的水平，并评估其作为生物学标志物的准确性和可行性，为血清miRNA作为生物标志物用于结直肠癌的临床诊断和预后判断提供依据。

1资料与方法

1.1研究对象

选取苏州市立医院2009年1月-2012年8月收治的98例结直肠癌患者（无转移者50例和存在转移者48例）的外周血，标本获得前患者未经任何放、化疗，患者均经病理检查确诊，无其他肿瘤病史。无转移者男性27例、女性23例；年龄35～70岁，平均年龄53.68岁：腺癌40例，黏液腺癌7例，印戒细胞癌3例；存在转移者男性25例、女性23例；年龄36～72岁，平均年龄54.96岁：腺癌36例，黏液腺癌7例，印戒细胞癌5例；按照美国癌症联合会(AJCC)第6版标准进行TNM分期，I期25例、Ⅱ期25例、Ⅲ期30例和Ⅳ期18例。同时募集50名健康志愿者为对照组，收集外周血。其中男性26例、女性24例；年龄34～66岁，平均年龄52.68岁。结直肠癌患者和健康志愿者的年龄和性别匹配(P>0.05)。所有标本的采集均获得患者的知情同意。

1.2方法

1.2.1血清样本的收集

采集所有待检者外周静脉血2mL，迅速转入不含EDTA的普通试管中，在水浴箱(37℃)中静置10min，至血液完全凝固。室温条件下，820×g离心10min，吸取上清液至洁净的1.5mL离心管中，4℃、16000×离心10min，小心吸取上清液到新的离心管中，置于-80℃冰箱中保存备用。

1.2.2血清总RNA的提取

取上述血清样本，每份400uL，按mirVanaTMPARISTM试剂盒说明书所述的方法抽提总RNA。取1uLRNA在NanoDropND-1000Spectrophotometer仪上测定RNA浓度。抽提获得的RNA置于-80℃冰箱中保存备用。

1.2.3实时荧光定量PCR检测

分别取98例结直肠癌患者血清总RNA和50名健康志愿者血清RNA60ng，应用miScriptReverseTranscription反转录试剂盒将其反转录为cDNA，反应条件：37℃1h，95℃5min。以cDNA为模板，应用miScriptSYBRGreenPCR试剂盒进行实时荧光定量PCR，以U6小核RNA(snRNA)为内参照[2]，各个miRNA和U6snRNA的特异性引物根据miRNA的序列及U6snRNA序列应用PrimerExpresssoftwarev2.0进行设计，引物序列见表1，引物由上海欧易生物医学科技有限公司合成，实时荧光定量PCR检测在7300定量PCR仪上进行。PCR反应条件：第1步，95℃预热15min；第2步，94℃15s、55℃30s、70℃34s，共40个循环。以2一△△Ct表示每个miRNA的相对表达量，△Ct=CtmiRNA—Ctu6。实验重复3次。

1.3统计学方法

应用Medcalc软件对实时荧光定量PCR检测结果进行Mann-WhitneyU检验和Kruskal-Wallis检验；通过受试者工作特征曲线(ROC)判断miRNA表达水平在结直肠癌诊断中的灵敏度和特异度，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1miR-92a表达水平在结直肠癌患者诊断中的价值

结直肠癌患者的血清miR-92a水平显著高于健康对照者（p<0.05），ROC曲线分析结果显示，血清miR-92a相对定量值(临界值为0.105)进行结直肠癌诊断时的灵敏度为75.26％，特异度为88.32％，曲线下面积(AUC)为0.863；miR-92a的AUC>0.7，与AUC=0.5比较，差异有统计学意义(P<0.05)，提示这个miRNA作为结直肠癌的生物标志物有一定的准确性和可行性。

2.2miR-92a表达水平在结直肠癌转移预后判断中的价值

结直肠癌肝转移患者的血清miR-92a水平显著高于未转移的CRC患者（P<0.05）。该生物标志物可产生最大受试者工作特征曲线(ROC)的曲线下面积(AUC)为0.896。在临界值为0.173时，鉴别转移性与非转移性CRC患者的敏感性为78.56％，特异性为86.59％。

3讨论

因血循环流经全身各处组织脏器,其中的代谢产物和细胞因子等能反映组织脏器的不同病理生理学水平的改变,甚至基因水平的改变。相对于组织miRNAs而言,血清miRNAs的优势在于无创便捷和水平稳定。最近几年来的研究均显示，多种肿瘤患者的外周血中都具有特异性循环miRNA的表达。血清或血浆在常温下放置24h以上或在强酸强碱环境中以及反复冰融样本多次也不影响miRNA的稳定性，而且显示出各自肿瘤特异性miRNA表达谱，具有明显的组织特异性，这些特征都表明了血清、血浆中的miRNA可作为生物学标志物的可能性和可行性。本研究通过应用实时荧光定量PCR法检测miR-92a水平。分析miR-92a表达与结直肠癌患者临床参数之间的相关性，判断血清miR-92a在结直肠癌早期诊断和预后判断中的价值。应用该miRNA进行结直肠癌诊断时的灵敏度为75.26％，特异度为88.32％；鉴别转移性与非转移性CRC患者的敏感性为78.56％，特异性为86.59％。Huang等发现miR-92a在CRC患者的血浆中明显增高,二者能有效地区分健康人、CRC患者和进展期结直肠腺瘤患者;miR-92a有早期鉴别诊断肝转移性CRC和非转移性CRC的潜在价值。本研究结果进一步支持了这个miRNA作为结直肠癌生物学标志物用于结直肠癌的早期诊断和预后判断的可能性。

本研究应用实时定量PCR检测了结直肠癌患者血清中miR-92a的表达，发现与正常对照组相比该标记物特异性表达上调与结直肠癌患者的预后有关，血清中特异性表达上调的miR-92a可以作为结直肠癌诊断和判断预后的指标。为了早期发现和诊断结直肠癌、改善患者预后并提高生存率，需要进一步扩大样本，验证和筛选结直肠癌特异性血清生物标志物组合，使其成为结直肠癌早期诊断及判断预后的灵敏、特异和无创伤性的简便的肿瘤检测方法。

目前通过检测血清miRNAs的方法实现早期诊断胃肠道疾病,还有许多有待于解决的问题。我们应积极开拓思路,从各个方面着手解决血清miRNAs诊断应用的难点问题,特别是组织特异miRNAs的确定、miRNAs检测方法的标准化和标准化的miRNAs诊断阈值的确定等。伴随研究水平的提高和应用难题的解决,相信血清miRNAs在今后临床无创诊断和监测疾病中会有广阔的应用前景。

参考文献

[1]尹少朋,徐峰,庞智.结肠癌相关miRNA的转化机制.世界华人消化杂志，2011，19(11):1101-110.

[2]刘寒梢，马越云，肖华胜.血清微小RNA(miR-129-3p、miR-767-3p和miR-877*)在结直肠癌诊断中的价值.肿瘤，2012，32(1)：42—48.