食品安全控制中噬菌体的作用研究

食品安全控制中噬菌体的作用研究

沈曼苗

佛山市海天（高明）调味食品有限公司广东佛山528000

摘要：近年来，噬菌体在食品科学领域中的应用受到国内外研究学者的广泛关注。噬菌体的自身特性表明，其可作为一种杀菌/抑菌的生物制剂来控制食源性病原菌对食品的污染，是保障食品安全的理想工具。对于相关领域科研工作者和同行业工作人员具有十分重要的参考意义。

关键词：食品安全控制；噬菌体；作用

1引言

噬菌体在发现的早期阶段被研究作为治疗细菌感染的药物，但由于当时对噬菌体的基本生物学知识缺乏了解，加上有限的实验技术条件，以及质量差的噬菌体制剂，噬菌体疗法曾一度被抗生素取代，具有很强的抑菌活性和广谱。

图1噬菌体

副溶血性弧菌是引起海产品食物中毒的主要病原菌。该菌为嗜盐菌，主要分布于海洋动物的表面组织、海底沉积物及海水中，因此在海产食品中此菌检出率很高。食用被该菌污染的海产品后，极易引起急性肠胃炎和败血症，随着现代海产品贸易和物流配送体系的完善，海产品的消费量逐年增加，该菌引发食源性致病菌的风险和暴露人群也在不断升高。传统的化学保鲜剂虽然具有良好的抑菌效果，但残留高，不利于人体健康。因此，开发新型的高效、无毒、廉价的天然抑菌剂用于控制海产品养殖、加工、保藏过程中致病菌的载量，符合人们对绿色产品的需求。噬菌体是细菌的病毒，能够专一性地裂解宿主菌，作用机理明确，具有对人体和动物安全等特点，几种有效抵抗食源性致病菌的噬菌体见表1。另一方面，噬菌体数量庞大，易于筛选，成本低廉，十分适合用于海产品等易腐败食品中主要病原菌的控制。

表1几种有效抵抗食源性致病菌的噬菌体

2实例研究

将－70℃菌种保存液在4℃解冻后，取100μL接种于5mL2216E液体培养基，37℃、150r/min培养6h后TCBS琼脂培养基上划线，37℃培养18h，挑取单菌落接种于5mL2216E液体培养基中，37℃、150r/min培养6h，放置室温备用。

2.1样品采集

45份污水样品采集自江苏省扬州市3个农贸市场，置于无菌离心管，4℃保存备用；新鲜黄鱼购自江苏省扬州市本地超市。

2.2噬菌体的分离和纯化

将污水样品5000r/min离心10min，取5mL上清液加入5mL2216E液体培养基中，同时加入100μL对数生长期的Vp宿主菌，37℃振荡培养8h后5000r/min离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，滤液经梯度稀释后与宿主菌混合倾注双层平板，37℃培养6～8h检测噬菌斑。挑取单个空斑至1mLSM缓冲液中，4℃过夜，用SM缓冲液倍比稀释噬菌体液，取适宜梯度加入宿主菌制成双层平板，37℃培养6～8h，重复培养5次，得到纯噬菌体备用。

2.3噬菌体的电镜观察

采用磷钨酸负染色法。取20μL噬菌体悬液（效价109PFU/mL）滴于复膜铜网上，吸附10min后取出铜网，空气中自然干燥2～3min；然后用2%的磷钨酸溶液进行染色，2min后吸干水分，空气干燥5min，用Tecnai-12透射电镜观察噬菌体形态。

2.4裂解谱测定

应用点斑法测定噬菌体的裂解谱，取5mL2216E半固体培养基加入50μL宿主菌（108CFU/mL），颠倒混匀后倾倒在固体培养基上，待凝固后，滴加噬菌体悬液（108PFU/mL）10μL，置培养箱中培养8～12h，观察裂解圈的形成。

2.5噬菌体pH值和热稳定性测定

取100μL109PFU/mL的噬菌体液与pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0的2216E培养基混合，37℃的水浴2h，测定噬菌体的效价，每组实验重复3次。取0.5mL的噬菌体（109PFU/mL），分别于50、60、70、80℃水浴作用20、40min和60min，作用结束后取样，测定噬菌体的效价，每一温度设3个平行。取平均值用于分析噬菌体pH值和热敏感性。

2.6最佳感染复数测定

噬菌体悬液（109PFU/mL）梯度稀释，与对数期的宿主菌液（108CFU/mL）按照MOI为0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、100的比例混合，加入10mL的2216E液体培养基中，37℃、150r/min培养6h；取1mL培养液8000r/min离心10min，取上清液测定噬菌体的效价，选择效价最高的MOI为最佳MOI。

2.7一步生长曲线测定

一步生长曲线的测定采用Lu等改进的方法。将噬菌体悬液（109PFU/mL）与对数期宿主菌悬液（108CFU/mL）按照MOI大于10的比例加入到2216E液体培养基，37℃恒温孵育10min，12000r/min离心30s，用2216E液体培养基洗涤沉淀3次；然后加入等体积预热的2216E液体培养基，37℃、150r/min振荡培养，每隔10min取样，测定噬菌体效价（lg（PFU/mL））。以时间为横坐标、噬菌体效价为纵坐标，绘制噬菌体的一步生长曲线。裂解量按裂解末期噬菌体的效价与裂解初期宿主菌的浓度比值进行计算。

2.8噬菌体不敏感突变频率的测定

参考文献：所述方法测定噬菌体不敏感突变频率。分别取新鲜培养的Vp菌悬液（105CFU/mL）和相应噬菌体悬液（108PFU/mL）各100μL混合，混合噬菌体BIMF测定取5株噬菌体（107PFU/mL）制成的混悬液（VppMIX）和相应5株宿主菌混合菌液（105CFU/mL）各100μL混合，在混合体系中加入CaCl2（0.01mol/L）和MgSO4（0.01mol/L），以不加噬菌体的Vp菌株作为对照，37℃静置培养10min，梯度稀释后涂布TCBS平板上，37℃培养18h，计算平皿中噬菌体抗性菌落总数（假定不敏感菌落数）。挑取所有抗性菌落，接种于2216E液体培养基，摇床培养8h，点斑法测定培养物对噬菌体的敏感性，计算没有裂解圈的菌株总数（确定不敏感菌落数）。BIMF为确定的不敏感菌落数量与没有添加噬菌体的菌落数比值。

2.9噬菌体对黄鱼中Vp的抑制作用

应用模拟污染的黄鱼肉作为模型测定噬菌体对海水鱼基质中Vp的抑制作用。采集新鲜黄鱼背部肌肉，切成2cm×2cm的小块，先用次氯酸钠浸泡15min，捞出沥干，无菌水漂洗5次，每次3min，沥干备用。将鱼肉样品分为4个处理组（每组30块）：实验组1：噬菌体处理，MOI=10000；实验组2：噬菌体处理，MOI=100；实验组3：噬菌体处理，MOI=1；对照组：空白，没有噬菌体处理。

将5种噬菌体液（109PFU/mL）等体积混合制成VppMIX，终体积为500mL，梯度稀释到107PFU/mL和105PFU/mL备用。将实验组和对照组鱼块先用Vp菌悬液（105CFU/mL）浸泡10min，捞出沥干；实验组1、2、3鱼块分别置于109、107、105PFU/mL噬菌体悬液中浸泡10min，捞出沥干，装入聚乙烯薄膜袋中；将对照组鱼块置于等体积的生理盐水中浸泡10min，沥干后装入聚乙烯薄膜袋中。将所有鱼块放置25℃进行恒温贮藏。分别在0、2、4、6、8、10、12、18、24h取鱼块，均质后，用生理盐水梯度稀释，涂布TCBS平板，37℃培养18h，人工计数菌落总数（lg（CFU/mL）），每组实验重复3次，比较不同处理组的抑菌效果。

2.10分析

噬菌体在食品及公共环境领域控制病原菌污染及危害具有良好的应用前景。分离筛选广谱高效的噬菌体分离株对构建高效的生物减菌剂具有重要价值。本研究从污水样品中筛选致病性Vp的烈性噬菌体，获得了5株噬菌体具有较宽的抑菌谱及良好的耐热能力，以及较广的pH值生存范围，为进一步研发食品加工温度和酸碱度下噬菌体减菌剂提供了分离株。

噬菌体大量存在于含有其宿主菌的环境中，目前分离到的Vp噬菌体形态主要属于肌尾噬菌体科、长尾噬菌体科、短尾噬菌体科。本研究发现5株噬菌体分离株分别属于这3个科，且针对同一个Vp宿主菌株的噬菌体存在不同形态，同一噬菌体可以对不同毒力基因型和来源的Vp产生裂解活性。查涛等研究发现噬菌体对不同血清型宿主菌表现出不同的裂解特征，产生不同形态的噬菌斑，但本研究中并未发现裂解特征与菌株基因型具有明显相关性。结果表明自然界Vp噬菌体存在高度多样性，其裂解性与宿主菌来源无关。

不敏感突变体的出现直接影响噬菌体的抑菌效果，不同噬菌体单株产生抗性突变频率（BIMF）变化很大，而噬菌体混合物的应用可以有效降低BIMF，扩大裂解宿主范围。O’研究表明较低的BIMF（10－6）并不影响将噬菌体用作生物控制剂，这与本研究的结果一致。本研究构建的5株Vp烈性噬菌体混合制剂VppMIX，不敏感突变株的产生频率降低到10－6以下，对42株Vp菌株均具有裂解作用，拓宽了抑菌谱。

参考文献：

[1]郭婷婷.乳杆菌噬菌体及其裂解机制的研究[D].山东：山东大学，2013.

[2]柴子涵.噬菌体聚糖酶在细菌生物被膜降解中的应用研究[D].山东：中国海洋大学，2012.DOI：10.7666/d.y2158050.

[3]牛冬燕.应用噬菌体控制牛及其饲养环境中大肠杆菌O157：H7的研究[D].辽宁：大连理工大学，2009.DOI：10.7666/d.y1486778.