TNF-α可介导谷氨酸对脊髓小胶质细胞的激活

TNF-α可介导谷氨酸对脊髓小胶质细胞的激活

史瑞红

史瑞红（古交矿区总医院山西古交030200）

【摘要】目的通过观察谷氨酸对脊髓小胶质细胞TNF-α释放的改变，探讨谷氨酸能否激活脊髓小胶质细胞以及激活的最佳浓度和时间点。方法原代离体培养脊髓小胶质细胞，分别用细胞培养液作为阴性对照组、50μM的ATP刺激细胞1小时作为阳性对照组以及谷氨酸通过不同浓度（500μM,1000μM和2000μM）分别作用三个不同的时间点（30分钟、1小时和2小时）作为实验组，通过ELISA法测定上清液中TNF-α的表达水平。结果500μM的谷氨酸孵育1小时，小胶质细胞释放TNF-α并开始被激活，对于1000μM和2000μM组，TNF-α在三个时间点增加量都非常明显(P＜0.05)，在1000μM2小时组，TNF-α释放量最多(P＜0.001)。结论谷氨酸能够激活脊髓小胶质细胞，且1000μM可能是其最佳浓度。

【关键词】谷氨酸脊髓小胶质细胞

【中图分类号】R96【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）23-0374-01

越来越多的研究表明胶质细胞是中枢神经系统中进行神经调制、神经营养和神经免疫的重要元件[1]。其中小胶质细胞受到如脑外伤、缺血以及感染等刺激时，就会有形态及TNF-α、NO的释放等系列性的变化[2]。谷氨酸作为一种重要的兴奋性神经递质，参与AD及兴奋性神经毒等疾病[3]，但这些研究只限于对神经元。而对小胶质细胞只是基于如脊髓神经的结扎和切断模型以及病理痛模型在体模型及脑皮层的研究，而对于谷氨酸刺激离体培养的脊髓小胶质细胞的情况尚不清楚。Tsuda等人已经证实50μMATP即可激活皮层小胶质细胞。因此，我们将50μMATP作为阳性对照，通过对离体的脊髓小胶质细胞外源性孵育谷氨酸，从而找到谷氨酸刺激脊髓小胶质细胞释放TNF-α的最佳浓度和时间。

1材料与方法

1.1原代培养脊髓小胶质细胞取出生1-2天的Wistar大鼠的乳鼠断头，用手术刀从背部划开将脊髓取出，剥去脑脊膜，将脊髓切成小块置于含有5%的木瓜蛋白酶中，在37℃下恒温消化25min。再加入含有10%马血清的DMEM/高糖溶液终止消化，用吸管吹打，尼龙网过滤上清液到50ml离心管中，以1000rpm的速度离心5min。弃上清重悬细胞，细胞密度大概为5×105个/cm2。培养9-14天后，将细胞置于恒温摇床上以180rpm摇2h，然后重悬上清培养1-2天之后，约95%的细胞为小胶质细胞。最后将细胞分组，收集上清液用于ELISA检测。

1.2实验分组根据在体谷氨酸的浓度(1mM)，我们以细胞培养液为阴性对照，ATP作为阳性对照（ATP500μM孵育1h），将谷氨酸根据不同浓度（500μM,1000μM和2000μM）和不同时间点（30min,1h和2h）分为9个组。

1.3ELISA检测严格按照ELISA试剂盒说明书检测TNF-α的含量。

1.4数据分析所有数据均为均数±标准差。以P＜0.05为具有统计学差异。

2结果

TNF-α的释放介导谷氨酸对脊髓小胶质细胞的活化

如表1所示，与对照组相比，ATP组释放的TNF-α显著增加；而谷氨酸500μM组要1小时才开始表达，在2小时显著增加。而对于1000μM和2000μM组，TNF-α在三个时间点都大大增加，在谷氨酸1000μM组孵育2小时达到峰值(P＜0.05)。

组别时间

30min1h2h

对照3.38±3.154.37±2.163.98±5.13

ATP21.93±7.0122.53±4.1720.85±3.12

Glu500μM5.64±3.2325.75±11.6334.54±0.14

Glu1000μM35.87±2.7532.56±8.6339.60±6.68

Glu2000μM18.92±2.5813.20±0.6630.04±12.40

表1.脊髓小胶质细胞孵育不同浓度于不同时间点时TNF-α的蛋白表达水平。P<0.05,

3讨论

小胶质细胞参与病理痛的重要作用引起了人们极大的重视。谷氨酸作为一种重要的神经递质，在本实验中显示可通过使小胶质细胞释放TNF-α诱导其被活化。与在体条件相似，可能1000μM是谷氨酸激活脊髓小胶质细胞的最佳浓度。而谷氨酸刺激脊髓小胶质细胞的机制目前尚不清楚。谷氨酸通过其不同类型的受体来发挥作用，如促离子型谷氨酸受体（分别为AMPA受体、NMDA受体和KA受体）以及代谢型谷氨酸受体（包括mGluRs1-8）。但这些实验主要基于脑区域，而对于脊髓小胶质细胞的受体仍需要根据不同的情况进行研究。介于脊髓小胶质细胞在病理痛中发挥着极其重要的作用，因此，谷氨酸激活脊髓小胶质细胞以及通过其受体进行介导，从而调控脊髓神经元的突触传递，可能是治疗病理痛的潜在靶点。

参考文献

[1]EdgarAlfonsoRomero-Sandoval,RyanJHorvath，JoyceADeLeo.Neuroimmuneinteractionsandpain:Focusonglial-modulatingtargets.CurrOpinInvestigDrugs[J].2008.9(7):726–734.

[2]MakotoTsuda,KazuhideInoue,MichaelW.Salter.Neuropathicpainandspinalmicroglia:abigproblemfrommoleculesin‘small’glia.TrendsinNeurosciences[J].2005.28(2):101–107.

[3]Hyoung-gonLee,XiongweiZhu,MichaelJ.O’Neill,etal.TheroleofmetabotropicglutamatereceptorsinAlzheimer’sdisease.ActaNeurobiolExp[J].2004.64:89-98.