HBV抗原肽-HLA-A*0201五聚体流式细胞技术检测慢性HBV感染患者特异性CD8+T细胞

HBV抗原肽-HLA-A*0201五聚体流式细胞技术检测慢性HBV感染患者特异性CD8+T细胞

刘先进1吴月平1张红春2韩刚1沈张平2宋健辉2季

刘先进1吴月平1张红春2韩刚1沈张平2宋健辉2季沈杰2陈琳1

（1南通市第三人民医院226006；2启东市人民医院江苏南通226006）

【摘要】目的研究不同临床感染状态慢性HBV患者外周血HBV特异性CD8+T淋巴细胞（CTL）频率的变化及临床价值。方法采用HBcAg18-27表位肽-HLA-A*0201五聚体（MHCPentamers）及CD8单克隆抗体，设计流式细胞技术检测外周血中针对该肽段的特异性CTL数量，以占总计数CD8+细胞数的百分比表示，同时对HLA-A2等位型进行鉴定。结果18例非HBV感染患者中12例HLA-A2-（对照组）特异性CTL数为0.33％-3.90％，中位数为1.04％。HLA-A2-的CHB、LC、HLA-A2+的CHB特异性CTL数为分别为0.25％-10.69％、中位数1.60％、n=24，0.34％-12.20％、中位数1.85％、n＝13，0.20％-29.90％、中位数1.41％、n＝24，三者与对照组无显著差异。HLA-A2-的PHC、HLA-A2+的LC、PHC特异性CTL数分别为1.27％-20.30％、中位数6.69％、n=5，0.14％-18.40％、中位数2.88％、n=18，0.72％-39.22％、中位数1.33％、n=7，三者显著高于对照组。HLA-A2-抗病毒治疗者特异性CTL数显著高于相应未抗病毒治疗者。HLA-A2+未抗病毒组中血清HBVDNA<103copies/mL、ALT<40IU/L者特异性CTL频率有增高趋势。结论HBV抗原肽-HLA-A*0201五聚体流式细胞技术能在体外直接检测外周血HBV特异性CTL频率的变化，其水平一定程度反映不同临床感染状态慢性HBV感染患者T淋巴细胞对特异性抗原表位免疫应答的差异。

【关键词】HLA-A2抗原MHC-五聚体CD8+T淋巴细胞流式细胞术

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）24-0032-03

乙型肝炎病毒(HBV)病毒本身及其在体内的复制并不引起肝细胞的损伤,它的发病机制主要是机体清除HBV而引发的细胞免疫病理改变,而特异性细胞（T辅助细胞、细胞毒性T细胞）免疫机制可能是乙型肝炎发病机制的中心环节；CTL活化以及生物学效应都严格受HLA-I限制，不同HLA-I等位型个体可以有不同的抗原表位，研究抗原特异性CTL必须结合具体HLA-I等位型。我们采用的表位肽是针对HLA-A*0201等位型个体（与HLA-A2相同），在四聚体基础上改进的五聚体(MHCpentamers)法结合流式细胞技术定量分析不同临床感染状态慢性HBV患者外周血抗原特异性CTL，探讨其临床应用价值。

1材料和方法

1.1研究对象91例慢性HBV感染患者中48例慢性乙肝（CHB）、31例肝硬化（LC）、12例原发性肝癌（PHC），诊断符合2000年第十次全国病毒性肝炎及肝病学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准。所有患者均排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒以及CMV、EB病毒、HIV感染，无自身免疫性疾病，无嗜酒史，无肝毒性药物使用史，其中51例进行核苷类药物抗病毒治疗。以18例手足口病、妊娠肝损害、酒精性肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎等非HBV感染者作对照。

1.2主要试剂及来源FITC结合鼠抗人HLA-A2单克隆抗体购自Serotec公司。FITC结合的鼠抗人CD8单克隆抗体、溶血素购自BDPharmingen公司，HLA-A*0201限制HBV抗原表位肽-五聚体复合体（Pro5TMMHCPrenamers）购自英国Proimmune公司，所含HBV抗原表位肽为HBcAg18-27，序列为FLPSDFFPSV。HBV血清标志物HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HbcAb检测试剂购自美国Abbott公司，血清HBVDNA含量检测采用上海科华试剂，检测限103copies/ml。

1.3HLA-A2等位型的鉴定采用流式细胞术,所有研究对象取100ul肝素钠抗凝新鲜全血,加入检测管和对照管,分别加入HLA-A2单克隆抗体及同型对照10ul,16-27℃，避光放置30min,经溶血、FACS洗涤液洗涤,FACS固定液固定,4℃保存,用于流式细胞仪检测，同时每份标本均设阴性对照。

1.4五聚体和CD8染色所有研究对象分设双阴性对照管、五聚体阴性和CD8阳性对照管、五聚体和CD8双阳性检测管，每管取新鲜肝素钠抗凝全血100ul，加入1ulMHC五聚体和10ulCD8单克隆抗体以及相应的同型对照混匀，避光冰上孵育30min，加2ml1×FACS裂解液室温10min,待细胞悬液变成真性溶液后,PBA液(含5g/L牛血清白蛋白,0.5g/L叠氮钠,0.01mol/LPBS)洗涤2次。10g/L多聚甲醛固定,用于流式细胞仪检测。

1.5流式细胞仪检测抗原特异性CTL采用贝克曼库尔特EPICSXL-4流式细胞仪。数据分析采用CELLQUEST数据分析软件进行。以淋巴细胞设门,计数20000个CD8阳性细胞。同时计数CD8和Pentamers双阳性细胞为HBV特异性的CTL细胞。特异性CTL细胞的阳性率(％)(Pentamers)=五聚体+CD8+／CD8+×100％。

1.6仪器及设备ABI7500荧光PCR仪；雅培AXSYM免疫分析仪；奥林巴斯AU2700生化仪；EPICSXL-4流式细胞仪。

1.7统计学处理采用SPSS10.0统计软件中的相关方法，实验结果以中位数（全距）表示，组间资料显著性分析采用卡方检验。

2结果

2.1HLA-A2等位型鉴定

18例手足口病、妊娠肝损害、酒精性肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎等非HBV感染者对照组中6例HLA-A2+、12例HLA-A2-。48例CHB中24例HLA-A2+、24例HLA-A2-；31例LC中18例HLA-A2+、13例HLA-A2-；12例PHC中7例HLA-A2+、5例HLA-A2-；慢性HBV感染者中HLA-A2+占53.8％（49/91）。

2.2抗原肽五聚体阳性细胞的检测

对照组12例HLA-A2-特异性CTL数为0.33％-3.90％，中位数为1.04％，6例HLA-A2+特异性CTL数为0.29％-3.30％，中位数为1.43％，HLA-A2+、HLA-A2-对照间无显著性差异P>0.05。HLA-A2-的CHB、LC、PHC特异性CTL数分别为0.25％-10.69％、中位数1.60％、n=24，0.34％-12.20％、中位数1.85％、n=13，1.27％-20.30％、中位数6.69％、n=5。HLA-A2+的CHB、LC、PHC特异性CTL数分别为0.20％-29.90％、中位数1.41％、n=24，0.14％-18.40％、中位数2.88％、n=18，0.72％-39.22％、中位数1.33％、n=7。统计学分析发现HLA-A2+的LC及HLA-A2-PHC、HLA-A2+的PHC患者外周血特异性CTL检出频率显著高于对照组，HLA-A2+、HLA-A2-的CHB、LC、PHC患者间外周血特异性CTL检出频率无显著性差异。

2.3特异性CTL数与抗病毒治疗、血清HBVDNA、ALT的关系

2.3.191例慢性HBV感染者51例进行核苷类药物抗病毒治疗，22例HLA-A2-,特异性CTL数0.25%-20.30%,中位数2.11％，29例HLA-A2+，特异性CTL数0.14%-39.22%,中位数1.33％；40例未抗病毒治疗者中20例HLA-A2-，特异性CTL数0.30%-14.40%,中位数1.13％，20例HLA-A2+,特异性CTL数0.20%-29.90%,中位数2.22％。统计学发现：HLA-A2-未抗病毒治疗者特异性CTL数与对照组间无显著差异P>0.05,余均高于对照组P<0.05或0.01。HLA-A2+抗病毒治疗者特异性CTL数与未抗病毒治疗者间无显著差异P>0.05，而HLA-A2-抗病毒治疗者特异性CTL数显著高于未抗病毒治疗者P<0.05。

2.3.2根据HBVDNA>105、105-103、<103copies/mL分类，HLA-A2-抗病毒治疗者特异性CTL数分别为0.38％-7.82％，中位数1.88％，n=6；0.84％-12.20％，中位数1.48％，n=4；0.25％-20.30％，中位数2.80％，n=12。HLA-A2+抗病毒治疗者特异性CTL数分别为0.14％-2.40％，中位数1.44％，n=4；0.58％-39.22％，中位数1.31％，n=11；0.32％-18.40％，中位数2.25％，n=14。统计学发现：血清HBVDNA<103copies者特异性CTL数较高但无显著性差异P>0.05。HLA-A2-未抗病毒治疗者特异性CTL数分别为0.34％-6.48％，中位数1.48％，n=12；0.93％-1.56％，中位数1.25％，n=2；0.30％-14.40％，中位数0.66％，n=6，组间无显著差异。HLA-A2+未抗病毒治疗者特异性CTL数分别为0.33％-10.00％，中位数1.55％，n=9；0.20％-3.05％，中位数1.93％，n=6；0.72％-29.90％，中位数5.17％，n=5，有增高趋势，且后两者间有显著差异P<0.05。

2.3.3根据ALT>100、40-100、<40IU/L分类，HLA-A2-抗病毒治疗者特异性CTL数分别为0.64％-2.14％，中位数1.39％，n=2；0.38％-10.69％，中位数2.08％，n=10；0.25％-20.30％，中位数3.43％，n=10。HLA-A2+抗病毒治疗者特异性CTL数分别为0.14％-39.22％，中位数1.72％，n=8；0.41％-5.41％，中位数1.03％，n=8；0.32％-18.40％，中位数2.30％，n=13，ALT<40IU/L者特异性CTL数有增高趋势，但组间无显著差异。HLA-A2-未抗病毒治疗者特异性CTL数分别为0.30％-6.48％，中位数0.99％，n=7；0.40％-2.73％，中位数1.27％，n=5；0.34％-14.40％，中位数1.25％，n=8；HLA-A2+未抗病毒治疗者特异性CTL数分别为0.33％-29.90％，中位数2.88％，n=6；0.20％-1.77％，中位数1.10％，n=5；0.72％-10.00％，中位数3.05％，n=9，后两者间有显著差异P<0.01。

3讨论

众多研究显示，细胞免疫在HBV感染中发挥主要作用，且与乙型肝炎发病机制密切相关；其中，针对HBV各类抗原表位的特异性CTL，作为主要的效应细胞，与病毒清除和肝细胞损伤直接相关[1]。CD8细胞的活化以及生物学效应都严格地受主要组织相容性复合物（MHC）-Ⅰ类分子限制（人的MHC称HLA复合体）。HLA等位基因是迄今为止发现的最具多态性的人类基因，与特异性CTL应答密切相关的主要是HLA-A、HLA-B、HLA-C，尤其是HLA-A。目前已确定的CTL，表位大多为HLA-A*020l限制[2]。本研究HLA-A2鉴定结果显示慢性HBV感染者中HLA-A2+占53.8％（49/91）。朴文花等[3]报道HLA-A2(A*0201)约占我国健康人的45％，占慢性乙肝患者的60％左右,也就是说，约60％的患者可用此类方法进行抗原特异性CTL的检测。

MHC-Ⅰ类分子是由重链α与保守的轻链即β2微球蛋白组成的异源二聚体，并形成一个肽结合槽，具有高度多态性。特异性CTL识别的抗原主要是结合MHC-Ⅰ类分子的内源性抗原肽，抗原肽(内源性抗原)是由抗原递呈细胞(antigenpresentcellAPC)加工合成，在细胞内质网中结合于由MHC-Ⅰ类分子重链(α1和α2功能区)构成的肽结合槽内。CTL通过细胞表面T细胞受体(TcellreceptorTCR)识别并结合那些提呈在靶细胞表面MHC-Ⅰ类分子肽结合槽内的特异性抗原表位(epitope)，在共同刺激信号的协助下活化、增生，形成表位特异性T细胞克隆活化的CTL细胞再通过相同的机制靶细胞结合而发挥生理效应。本文实验所用MHC-肽五聚体是根据T细胞活化的双识别原理，用生物工程技术将MHC-Ⅰ类分子重链α与β2微球蛋白在体外组装，并结合抗原表位肽形成一个能够与相应TCR特异性结合的单体，再将5个单体组装在一起称为五聚体，五聚体用荧光染料标记供流式细胞仪检测，可以用于具有特定TCR的T细胞的研究。王洪[4]等利用可溶性MHC-肽四聚体（tetramers）检测慢性肝炎患者的特异性CTL，一般为0.05％-1.20％，虽然tetramers法有较高的敏感性，但在慢性乙肝患者体内检测出特异性CTL仍较低.不同患者之间和同一患者不同病程阶段进行比较时有一定的困难；我们应用MHC-五聚体法(MHCpentamers)的5个MHC-肽复合物呈平面构象，每个MHC-肽复合物均可与T细胞受体(TCR)结合,而tetramers的4个MHC-肽复合物呈四面体构象,至多只有3个MHC-肽复合物可与同一T细胞表面的TCR结合，故pentamers比tetramers有更高的亲合力，从而能够检测更低亲合力的T细胞；另一方面，MHCpentamers法有更强的信号和减少背景染色，能够有更高的敏感性来检测稀少的抗原特异性CTL。所以本研究对象特异性CTL水平均高于文献的报道;HLA-A2-CHB患者外周血特异性CTL检出频率与HLA-A2-非HBV感染患者无显著差异；HLA-A2+的LC及HLA-A2-、HLA-A2+的PHC患者外周血特异性CTL检出频率显著高于HLA-A2-非HBV感染患者。表明在慢性HBV感染时，患者体内抗原特异性CTL与HBV并存，特异性CTL的存在并不能代表机体的保护性反应。一般认为慢性HBV感染外周血中出现频率大概占总CD8+T细胞的比较低，而肝内相对较高,因此推测过低的抗原特异性CTL反应可能是肝炎病毒感染更容易慢性化的原因之一；不同的临床表现患者抗原特异性CTL数量存在明显差异，可能与慢性HBV感染者肝内大量“扣留”并消耗该类细胞有关，也可能与高浓度的病毒抗原，特别是e抗原引起的免疫耐受有关[5]。

在HBV感染者特异性CTL水平高低与病毒清除和ALT水平研究方面有两种见解[4、6]：“有一定的联系”、“没有直接的关系”，本文资料发现HLA-A2+未抗病毒组中血清HBVDNA<103copies/mL、ALT<40IU/L者特异性CTL频率有增高趋势，说明在慢性感染患者之间低病毒复制肝损伤轻者比高病毒复制肝损伤重者高，与文献报道[7、8、9]结果有一定相似性。HLA-A2-抗病毒治疗者特异性CTL频率显著高于相应未抗病毒治疗者，提示特异性CTL检测对抗病毒治疗有指导意义。由于本文病例数偏少、分组多，一定程度影响结果分析，我们准备扩大病例数及进行抗病毒前后的动态检测研究。

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（南通市科委课题编号S9923）