γ-氨基丁酸A受体及受体基因在大鼠急性脑缺血中的变化

γ-氨基丁酸A受体及受体基因在大鼠急性脑缺血中的变化

张茂林

张茂林张俊清薛钢王伟孙智敏(包头医学院第一附属医院神经内科内蒙古包头014010)

【中图分类号】R743.31【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）37-0238-02

【摘要】目的观察大鼠大脑皮质γ-氨基丁酸A受体(GABAAR)及受体基因(GABAARα1mRNA)在脑缺血不同时段的表达及其动态变化的规律,探讨其在急性脑缺血中变化的意义。方法55只雄性Wistar大鼠随机分为对照组,脑缺血6h组、12h组、24h组、3d组、7d组（均为手术组),假手术组;采用大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,至规定时间点取大脑组织,用光学显微镜观察神经元损伤程度，用形态分析系统检测各组GABAAR表达的阳性细胞数。用地高辛标记寡聚核苷酸探针原位杂交技术与计算机分析系统在光学显微镜下观察GABAARα1mRNA在大脑皮质阳性神经元的表达情况。结果各手术组GABAAR及GABAARα1mRNA表达均低于假手术组及对照组,与对照组相比,GABAAR在缺血6h其表达既有降低,至12h降至最低。GABAARα1mRNA表达在缺血24h开始下降,3d下降显著,7d恢复正常，而假手术组与对照组相比无统计学意义。结论GABAAR及GABAARα1mRNA在急性脑缺血时含量降低可能为脑缺血时脑损伤的重要原因。

【关键词】γ-氨基丁酸A受体γ-氨基丁酸A型受体基因脑缺血

ChangesofExpressionofGABAARandGABAARα1mRNAInducedbyAcuteCerebralIschemiainRats

ZhangMaolin,ZhangJunqing,Xuegang,etal

(Departmentofneurology,TheFirstAffiliatedHospital,BaotouMedicalcollege,Baotou014010,China)

【Abstract】ObjeciveToobservetheexpressionofGABAARandGABAARα1mRNAandthedynamicregulationinthecortexofratswithfocalcerebralischemiaindifferentphasesandtoinvestigateitssignificanceinacuteischemia.Methods:Fifty-fivemaleWistarratswererandomlypidedinto11groups:Thenormalcontrol,shamoperationandischemicoperationgroup(subpidedinto6,12,24hourand3,7days)bymiddlecerebralarteryocclusionmodel.Brainspecimensoftheratsfromeachgroupwereobtainedtoobservethedamageofneuronswithlightmicroscopeandtojudgethepositiveexpressionofneuronsinimmunohistochemistrytechnique,andthentodeterminethepositivecellnumberex-pressedbyGABAARineachgroupwithmorphologicanalysissystem,andthechangesofGABAARα1mRNAexpressionwereobservedunderlightmicroscopewithdigoxinlabeledoligonucleotideprobeinsituhybridizationmethodandcomputeraidedimageanalysis.Results:Comparedwiththenormalcontrolgroupandtheshamoperationgroup,theexpressionofGABAARandGABAARα1mRNAineachischemiaoperationgroupwasdecreased.theexpressionofGABAARwasdecreasedafter6handreachedthebottomwithin12hoursafterischemia.theexpressionofGABAARα1mRNAwasdecreasedfrom24handwasthelowestwithin3dandrecoveredtonormalin7dafterischemia.However,therewasnosignificantdifferencebetweenthenormalcontrolgroupandshamoperationgroup.Conclusion:ItissuggestedthatthedecreasingofcontentofGABAARandGABAARα1mRNAafterischemiamightberelatedwithischemia-injury.

【Keywords】GABAARGABAARα1mRNACerebralischemia

γ-氨基丁酸(GABA)是中枢神经系统中重要的抑制性氨基酸,在神经元损伤中与主要的兴奋性递质谷氨酸(Glu)相抗衡。GABA可阻断Glu兴奋性毒性,抑制细胞膜去极化和Ca2+内流,具有神经保护作用。介导GABA中枢效应的受体至少有三种不同类型,即GABAA、GABAB、GABAC受体,其中以GABAA受体分布最为广泛,在缺血性脑损伤的神经保护中占主导地位。哺乳类大脑中天然GABAA受体主要是由α、β和γ亚基组成。其中α亚基对GABAA受体复合物的组装及功能可能起主要作用。GABAAR功能障碍与多种神经和精神疾病,如脑缺血、癫痫、焦虑、抑郁、疼痛等有关[1]。对GABAA型受体及GABAARα1mRNA的研究,目前多集中在癫痫、抑郁症[2-4]等方面,在缺血性脑血管方面研究甚少。本研究以线栓法建立大脑MCAO模型,对大鼠脑组织中GABAA受体及GABAARα1mRNA进行检测,来观察γ-氨基丁酸A型受体及受体基因在脑缺血再灌注损伤中的动态变化规律及其作用机制。

1材料与方法

1.1研究对象健康Wistar雄性大白鼠55只,体质量260～310g,由内蒙古大学动物试验中心提供。将动物随机分为:正常对照组,脑缺血2h再灌注6h、12h、24h、3d、7d组(手术组)及假手术对照组,每组5只。

1.2方法

1.2.1动物模型制作:采用右侧大脑中动脉线栓法(MCAO),大鼠用10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉,取仰卧位固定于鼠台,碘伏消毒后颈部正中切口,暴露右颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉,结扎颈总动脉和颈外动脉近心端,血管夹夹闭颈内动脉,在近颈总动脉分叉处留置一条结扎线以便插线后固定鱼线,在颈总动脉近分叉处剪一约0.3cm小口,将头部蘸有石蜡的鱼线(线直径0.26mm,长50mm)经小口处插入,沿颈内动脉入颅,进线深度由分叉处算约20mm,稍感阻力时停止,此时已至大脑中动脉起始处,以活结结扎用于固定鱼线的结扎线,缝合手术切口,缺血2h后将线栓抽出,松开颈总动脉上的活结造成缺血再灌注模型,假手术对照组除不插鱼线外,其余步骤同缺血组。

1.2.2标本取材和石蜡切片制作:分别在上述规定时间点,给予大鼠10%的水合氯醛0.5ml腹腔注射麻醉,剪开胸腔经左心室快速输入0.9%氯化钠注射液,同时剪开右心耳,待血色变淡后快速输入4%多聚甲醛磷酸缓冲液(含有1/1000DEPC)固定脑组织,待鼠颈及四肢僵硬后,停止灌注,快速断头取脑置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液(含有1/1000DEPC)固定保存。取视交叉前后约4mm厚脑组织经常规脱水、浸蜡、包埋。石蜡切片连续冠状切片,42℃温水展开,片厚6μm,将石蜡切片贴于涂有多聚赖氨酸的切片上,置于60℃烤箱内过夜,放4℃冰箱待用。

1.2.3免疫组化法检测GABAAR采用链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法染色(SABC法)。

1.2.4GABAARα1mRNA的检测采用原位杂交法。

1.2.5观察项目和统计学处理:在400倍显微镜视野下计数各组脑组织大脑皮层GABAAR及GABAARα1mRNA阳性神经元数及观察其阳性神经元表达的改变。采用江苏捷达科技公司的形态分析系统进行图像分析,每张切片随机选取10个高倍视野,测量阳性神经元数目。采用SPSS13.0软件进行统计处理,各组数据用均数±标准差(x±s)表示,所用统计学方法用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1组织形态学改变光镜下正常对照组和假手术组神经元形态学无异常,阳性细胞胞浆着色呈棕黄色;手术组部分神经元结构表现出坏死前样改变,包括细胞核浓缩、胞浆着色变淡、细胞结构不清,缺血重的组织内甚至可见液化性坏死灶,灶内神经元残存较少甚至缺失。

2.2阳性细胞数表达情况

2.2.1GABAAR阳性细胞计数比较与对照组相比,各时间点假手术对照组神经元阳性细胞数均无明显改变(P>0.05);与假手术组相比较,缺血组神经元阳性细胞数于脑缺血后6h即有降低,12h降至最低,故GABAAR表达于脑缺血后6h即有明显降低(P<0.05),12h降至最低。见表1。

表1各组GABAAR阳性细胞数的变化（个/视野）

与正常和相对应的假手术组比较,*P<0.01

3讨论

目前的大量研究已表明,GABAAR介导的生物效应在缺血性脑损伤的保护作用中起着重大作用。我们在大鼠MCAO模型的基础上,揭示了脑缺血自然病程中GABAAR及其基因的变化过程。伤后不同时间,GABAAR及受体基因弱阳性神经元多为缺血较重的神经元。提示在缺血性脑血管病的自然病程中,GABAAR及受体基因参与了缺血性脑损伤的过程。我们的研究表明,正常组与各假手术组无差异,说明单纯的手术操作对GABAAR及其基因的表达无明显影响。GABAAR在脑缺血后逐渐下降,缺血再灌注6h后开始持续下调,12h最为显著,这也说明GABAAR在继发性神经元损伤中可能发挥着重要的作用。结合以前的研究结果,即血液和脑脊液中的GABA在缺血性脑血管病中呈先升高后降低的双相变化,在缺血后GABA明显增高,再灌注后降低。我们推测脑缺血时GABAAR数量出现的改变可能与脑缺血损伤时细胞外液中GABA大量堆积,负反馈调控机体GABAAR表达的缘故,也可能是由于受体内移造成的。此外,尚有研究证实，选择性NMDA受体激动剂或拮抗剂也可调节GABAAR功能和亚单位的表达,因而推测脑缺血时细胞外液中高浓度的谷氨酸激动NMDA受体可能也参与GABAAR结构的变化[5]。至于迟发性GABAAR密度和分布的变化,则可能与脑缺血时神经元的降解有关。

ElenaAle-kseevnaKharlamov等[6]研究显示,光化学诱导血栓性脑梗死后,GABAARα1mRNA在梗死后7d下降明显,30d开始上升,说明缺血损伤后,其代偿机制具有复杂的时间依从性,GABAARα1mRNA在梗死后7d下降,可能由于mRNA转录水平下降或者是mRNA稳定性下降导致。本研究结果显示,脑缺血24h时,GABAARα1mRNA含量降低,3d时降至最低,推测,GABAARα1mRNA含量的变化与脑缺血再灌注损伤有关。与先前的研究相比较,GABAARα1mRNA含量降低及恢复正常的时间段不同,这可能与所采用的试验方法与技术以及缺血模型制作方法不同有关。本试验应用原位杂交技术充分证实大鼠脑缺血再灌注24h～3d时脑组织中GABAARα1mRNA的表达降低,提示缺血再灌注后GABAARα1mRNA转录受阻或其稳定性下降所致。

从以上研究结果来看，开发和利用拟GABA类药物以及促进或恢复GABAAR功能的药物以及利用碱基配对原则人工合成氨基酸,作用于GABAARα1mRNA转录过程,减轻脑缺血后再灌注损伤,可能达到脑保护作用。

参考文献

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