试论临床微生物检验

试论临床微生物检验

张秀丽(黑龙江省农垦总局宝泉岭农场疾病控制中心黑龙江

1标准化的微生物标本采集方法

1.1基本原则

1.1.1发现感染应及时采集微生物标本作病原学检查，二、三级医院微生物标本送检率不应低于70%。

1.1.2尽量在抗菌药物使用之前采集标本。

1.1.3标本采集时应严格无菌操作，减少或避免机体正常菌群及其它杂菌污染。

1.1.4标本采集后应立即送至细菌室。床旁接种可提高病原菌检出率。

1.1.5以棉拭子采集的标本如咽拭子、肛拭或伤口拭子，宜插入运送培养基送检。

1.1.6送检标本应注明来源和检验目的，使细菌室能正确选用相应的培养基和适宜的培养环境。

1.2血液与骨髓的送检方法

标本采集质量直接关系到血液培养的阳性率,而标本采集质量受多种因素影响,如采血的时间、部位、容量和采血的频率，因此严格掌握每种因素都克提高血液培养的阳性率。

1.2.1一般原则:在出现临床症状后应尽快抽学样作培养，最好在发热初期和高峰或寒战时，原则上应选择在抗菌药物应用之前，对已应用药物而病情不允许停药的患者也应在下一次用药前采血。

1.2.2通常采血部位为肘静脉。疑似细菌性心内膜炎时，以肘动脉或股动脉采血为宜，切忌在静滴抗菌药物的静脉处采取血标本。

1.2.3采血部位的局部皮肤应严格消毒。将采集的血液注入血培养瓶前，应更换针头或过火消毒针头。

1.2.4每次采血量成人5～10ml，婴幼儿1～2ml，培养基与血液之比以10：1为宜，以稀释血液中的抗生素。

1.2.5怀疑菌血症因尽早采血，体温上升阶段采血可提高阳性率，但要防止因等待而延误时机。对已用抗菌药物而不能停药者，可在下次用药前采血。

1.2.6对疑为细菌性骨髓炎或伤寒病人，在病灶或髂前（后）上棘处严格消毒后抽取骨髓1ml作细菌培养。

1.3尿液的送检方法

1.3.1中段尿：女性采样前应先用肥皂水或0.1%高锰酸钾溶液冲洗外阴部及尿道口；男性须翻转包皮冲洗，用0.1%新洁尔灭消毒尿道口，灭菌纱布擦干后，收集标本。

1.3.2导尿管导尿采样可减少污染。对留置导尿者，可用碘酒消毒尿道口处的导尿管壁，用联空针筒的细针斜穿管壁抽吸尿液；或拔去闭式引流的集尿袋，弃取导尿管前段尿液，留无污染的膀胱内尿液数毫升送检。不可从集尿袋的下端管口留取标本。

1.3.3送检标本以晨起第一次尿为宜。

1.3.4室温下尿标本担搁稍久可导致尿内细菌浓度明显增加而影响病原菌与污染菌的区分。不能立即送检者，可暂存4℃冰箱。

1.4痰标本的送检方法

1.4.1咳痰：清水反复漱口后用力咳痰，从呼吸道深部咳出新鲜痰液于无菌容器送检。痰量极少者可用45℃10%氯化钠溶液雾化吸入导痰。

1.4.2对咳嗽乏力或昏迷病人，可用吸痰管经鼻腔或口抵达气管腔内吸引痰液。用纤维支气管镜可直接在病灶部位采集高浓度的感染病原菌，但不能完全避免咽喉部正常菌群感染。

1.4.3双侧肺部感染伴人工气道如气管切开或气管插管患者，可用吸痰管经人工气道估插至叶支气管水平吸引痰液。

1.4.4痰标本不能及时送检者，可暂存4℃冰箱。室温下担搁数小时定植于口咽部的非致病菌呈过度生长而肺炎链球菌、葡萄球菌和流感嗜血杆菌检出率明显降低

1.5手术创口、烧伤创面于脓液

1.5.1无菌生理盐水擦洗病灶表面后，用棉拭子采取病灶深部的脓液和分秘物，置运送培养基内送检。

1.5.2对未溃疡的脓肿宜用碘酒、酒精消毒皮肤后，以无菌注射器抽取脓液送检；也可于切开脓肿时用无菌棉拭子采样。

1.5.3采样前病灶局部应避免用抗菌药物或消毒剂。

2临床常见细菌

2.1血标本

2.1.1常见细菌

革兰阳性菌：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性链球菌、粪肠球菌、类白喉棒状杆菌、产单核李斯特菌等。

革兰阴性菌：脑膜炎奈瑟菌、卡他布兰汉菌、伤寒沙门菌、流感嗜血杆菌、大肠艾希菌、变形杆菌、产汽肠杆菌、铜绿假单孢菌、肺炎克雷伯菌等。

2.1.2临床意义

血液培养应用于伤寒、副伤寒、化脓性细菌和其他革兰阴性杆菌引起的败血症的诊断。目前引起败血症的细菌多为金黄色葡萄球菌和大肠艾希菌。疥、痈和脓肿继发的败血症主要是金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌引起。尿道、胆、胃肠黏膜损伤引起的败血症以大肠艾希菌多见，其次为变形杆菌、产汽肠杆菌、葡萄球菌。急性细菌性心内膜炎以金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、脑膜炎奈瑟菌常见；亚急性心内膜炎以草绿色链球菌多见，偶见肠球菌；化脓性心包炎以金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎链球菌多见。血液病、肝硬化引起的败血症金黄色葡萄球菌和铜绿假单孢菌为主。弥漫性血管内凝血以革兰阴性杆菌为主。烧伤后败血症以铜绿假单孢菌为主。

3细菌耐药机制的新进展

3.1肠球菌肠球菌的β-内酰胺类、氨基糖甙类抗生素由内在耐药性。这是由于青霉素蛋白（PBP）对β-内酰胺亲和力较低，但和氨基糖甙类合用则可产生杀菌作用。当其PBP改变，过量产生PBP，以及产生β-内酰胺酶，肠球菌可对β-内酰胺产生获得性耐药。对氨基糖甙通过改变核糖体靶位，抗生素运输障碍和无活酶产生而获得耐药。肠球菌对万古霉素耐药目前以知有三种表型：VanA、VanB、VanC。VanA对万古霉素和替拉考宁均产生诱导型高度耐药。VanB诱导型对万古霉素耐药但对替拉考宁敏感，VanC是结构型耐药对万古霉素低度耐药，对替拉考宁敏感。

3.2肺炎链球菌其耐药机制是多种PBP发生改变，使青霉素G的结合理力下降。肺炎链球菌通过转化和其它链球菌发生重组，而使PBP基因呈拼图样改变。对青霉素G高耐药还同时对头孢菌素，如：头孢噻肟、头孢曲松等耐药。

3.3金黄色葡萄球菌耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（NRSA）使典型的多重耐药菌，同时对β-内酰胺类、庆大霉素、环丙沙星发生耐药。凝固酶阴性葡萄球菌较金葡菌更为耐药，并呈现多重耐药性。MRSA仅对万古霉素敏感。目前细菌室常规检测MRSA、MRSE以及葡萄球菌产β-内酰胺酶。

3.4革兰阴性杆菌的耐药性产灭活酶使革兰阴性杆菌耐药机制中最重要的一种,目前研究比较清楚的β-内酰胺酶有4类：A类:包括TEM和SHV质粒介导的β-内酰胺酶.超广谱β-内酰胺酶。B类:金属酶，代表菌株为嗜麦芽窄食单胞菌，由质粒介导。C类：染色体介导的头孢菌素酶，代表菌株为阴沟肠杆菌。D类：OXA－型质粒介导的β－内酰胺酶。对超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）目前细菌室常规检测。细菌由于产超广谱β-内酰胺酶导致了表观敏感性，因此建议临床治疗产ESBLs菌株的感染避免使用第三代头孢菌素和安曲南，无论体外试验是否敏感，即使需要第三代头孢菌素，也应该对接受治疗的患者作适当选择。碳青霉烯类和第四代头孢菌素可为治疗选择，但应注意第四代头孢菌素的耐药以达到较高的水平。