ELISA联合荧光定量PCR检测丙型肝炎病毒的临床应用研究

ELISA联合荧光定量PCR检测丙型肝炎病毒的临床应用研究

骆海涛毛齐学何宁刘大鹏房丹丹

骆海涛毛齐学何宁刘大鹏房丹丹

【摘要】目的：探讨酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光定量逆转录聚合酶链反应（FQ-PCR）、联合检测丙型肝炎病毒的临床意义。方法：用ELISA方法联合FQ-PCR检测156例临床已确诊为丙型肝炎患者的血清，同时检测它们的丙氨酸氨基转移酶（AAT）。结果：①抗-HCV阳性率随着HCV-RNA含量的升高而增高，其阳性率与HCV-RNA含量呈正相关。②119例HCV-RNA阳性标本中，有78例ALT异常，其异常率随着HCV-RNA含量的升高而增高，ALT异常率与HCV-RNA含量呈正相关，ALT水平和HCV-RNA含量之间呈正相关。③ELISA法检测敏感性为80.1%（125/156），漏检率为19.9%（31/156）。FQ-PCR检测敏感性为76.3%(119/156)，漏检率为23.7%（37/156）。两种方法联合检测敏感性为94.9%(148/156)，漏检率为5.1%（8/156）。结论：两种方法联合检测，大大提高了丙型肝炎病毒的检出率，为临床早期，准确诊断丙型病毒肝炎、监测病情、观察疗效提供了有力的依据，为献血人员筛选和临床输血的血制品安全提供了有力保障。

【关键词】：酶联免疫吸附试验；丙型肝炎病毒抗体；荧光定量逆转录聚合酶链反应；丙型肝炎病毒核酸；丙氨酸氨基转移酶

【中图分类号】R564【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)04-0047-01

我国一般人群抗-HCV阳性率为3.2％［1］，急性丙型肝炎绝大多数都将形成慢性丙型肝炎，是形成肝硬化和肝癌的重要原因。目前，医院和血站大多采用ELISA法检测血清中抗-HCV来诊断可疑感染者和筛选献血员。但ELISA法检测血清抗-HCV敏感性不高，存在30％左右的漏检率[2]，耽误了一部分患者疾病的治疗和引起输血后HCV感染的流行。因此，我们用ELISA方法联合FQ-PCR检测156例临床已确诊为丙型肝炎患者的血清，并同时检测血清ALT。探索能够提高丙型肝炎病毒检出率的方法，为临床诊断丙型病毒肝炎，判断病情和疗效提供参考依据。

1对象和方法

1.1对象:选取齐齐哈尔市中医医院2010年1月～2010年10月门诊和住院患者156例，男87例，女70例，年龄12～75岁，平均47.0岁。全部病例均为已确诊慢性丙型肝炎患者，排除其它型肝炎引起肝损伤的患者。诊断严格按照2000年西安中华医学会传染病与寄生虫分会、肝病学会联合修订的病毒性肝炎防治诊断标准。根据HCV-RNA含量(拷贝/mL)将资料分为<1×103、103～104、104～105、105～106和>106一共5个组。

1.2方法：

1.2.1抗-HCV检测:抗-HCV检测采用ELISA法，严格按试剂盒说明书操作，试剂盒由珠海丽珠生物工程有限公司提供。

1.2.2血清HCV-RNA定量检测:HCV-RNA的检测采用FQ-PCR，试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供，核酸扩增仪为杭州博日FQD-33A全自动实时荧光定量PCR仪，参考值<1×103拷贝/mL。

1.2.3ALT检测:血清ALT检测采用酶动力学法，正常参考值：5～40U/L(37℃)，试剂采用美国贝克曼原厂试剂，检测仪器为美国贝克曼DXC800全自动生化分析仪。

1.2.4统计学处理:采用SPSS11.0统计软件，计数资料用χ2检验，计量资料以(X±S)表示，组间比较用t检验，对HCV-RNA含量的对数值与ALT含量进行线性相关关系分析和相关性显著性检验，P<0.05为差异有显著性。

2结果

2.1HCV-RNA含量与血清抗:156例标本经FQ-PCR定量检测，有119例HCV-RNA含量高于1×103拷贝/mL，其中抗-HCV阳性105例，阳性率为88.2%（105/119），而低于1×103拷贝/mL血清标本中，抗-HCV阳性率为54.1%(20/37)，经相关性分析，两者有明显相关性(χ2=15.345，P<0.05)。抗-HCV阳性率随着HCV-RNA含量的升高而增高，经相关性分析，其阳性率与HCV-RNA含量呈正相关(r=0.908，P<0.05)。

2.2HCV-RNA含量与血清ALT含量关系:119例HCV-RNA含量高于1×103拷贝/mL血清标本中，有78例ALT异常，其异常率随着HCV-RNA含量的升高而增高，经相关性分析，ALT异常率与HCV-RNA含量呈正相关(r=0.921，P<0.05)，而ALT水平和HCV-RNA含量之间亦呈正相关(r=0.894，P<0.05)。

2.3FQ-PCR联合ELISA检测结果:FQ-PCR检测敏感性为76.3%(119/156)，漏检率为23.7%（37/156）。ELISA法检测敏感性为80.1%（125/156），漏检率为19.9%（31/156），两种方法检测血清标本敏感性差异无显著性（χ2=0.186，P>0.05)。两种方法联合检测敏感性为94.9%(148/156)，漏检率为5.1%（8/156）。联合检测敏感性明显高于单独检测(χ2=9.856，P<0.05)。

3讨论

HCV-RNA检测是诊断HCV感染的直接可靠的指标，FQ-PCR方法具有敏感性高、特异性强、自动化程度高和操作简捷等优点。抗-HCV试剂采用间接酶联免疫法，国内多采用第三代抗-HCVELISA试剂，它包被的抗原为HCV抗原、NS3、NS4和NS5抗原，特异性达到99.0%。本研究中HCV-RNA阳性率为76.3%，漏检率为23.7%。有6例标本HCV-RNA阴性，而抗-HCV阳性。这可能与抗-HCV抗体为IgG类抗体，特异性差，维持时间长、患者接受抗病毒治疗后，HCV复制受限、血液中HCV-RNA含量呈阶段性变化、病毒株发生变异等因素有关。抗-HCV阳性率为80.1%，漏检率为19.9%。有8例标本抗-HCV阴性，而HCV-RNA阳性。漏检率高的原因可能是由于部分患者处于感染的早期阶段，机体未产生免疫应答或弱表达，而未产生抗体、或者产生的抗体过少，而检测不到、还可能是病毒株发生了变异等原因。两种方法联合检测阳性率为94.9%，漏检率为5.1%，二者互相补充，大大提高了丙型肝炎病毒的检出率。本实验研究结果显示，抗-HCV指标阳性率随HCV-RNA含量的增高而增高，ALT异常率及平均含量随HCV-RNA含量的增高而增高。对患者血清HCV-RNA含量的对数值与ALT含量进行相关性分析和相关性显著性检验，表明HCV-RNA含量与ALT水平呈正相关。ALT水平升高反映肝细胞破坏程度加剧，ALT下降表示抗病毒的治疗取得疗效，提示HCV-RNA含量与肝功能损伤呈正相关。

综上所述，FQ-PCR和ELISA联合检测为临床早期，准确诊断丙型病毒肝炎、监测病情、观察疗效提供了有力的依据，为献血人员筛选和临床用血的血制品安全提供了有力保障。

参考文献

[1]中华医学会肝病学分会、传染病与寄生虫病学分会.丙型肝炎防治指南［J］.中华肝脏杂志,2004,12:194198

［2］文汉成,安社刚,张红芳.抗-HCV与HCV-RNA检测结果不一致原因分析［J］.实用医技杂志,2004,11(8):17071708

作者单位：161000齐齐哈尔市中医医院