HBVDNA荧光定量PCR检测及临床意义

HBVDNA荧光定量PCR检测及临床意义

孙东凯

孙东凯（黑龙江省北安分局龙门农场医院黑龙江北安154006）

【中图分类号】R512.6+2【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2011)12-0184-02

【关键词】HBVDNA荧光定量PCR检测

血清HBV-DNA浓度与乙型肝炎病毒感染的严重程度和传染性有关，可用于判断病情和预后，以及观察抗病毒药物的治疗效果。通常血清HBV-DNA持续阳性超过6个月会转为慢性肝炎。抗-HBc阳性患者血清HBV-DNA持续阳性常提示肝受损严重,50%以上抗-HBc阳性慢性活动性肝炎患者，经平均4.5年发展为肝硬化，常与HBV-DNA持续阳性有关。因此，采用荧光定量PCR检测方法，对乙肝早期诊断、准确判断乙肝患者的带毒状态及药物治疗观察就显得及其重要。

1资料与方法

1.1一般资料选取2008年10月～2009年10月，就诊患者检查200例HBVm全阴者血清样本。

1.2血清标本的采集采用灭菌的一次性带盖塑料管，清晨空腹抽取静脉血5ml，离心分离血清，-20℃冻存备用，集中检测。

1.3方法荧光定量PCR法检测HBV-DNA，检测仪器为RocheLightˉCycle荧光PCR检测仪，按照试剂盒说明书操作程序对上述血清标本进行检测。HBV-DNA提取:血清100μl加DNA提取液1100μl,13000r/min离心10min→弃上清→再加提取液Ⅱ25μl,振摇10s→100℃10min→13000r/min离心10min，上清液备用。扩增取上清液2μl，加入盛有扩增反应液38μl(含引物，dNTPs，Taq酶及PCR缓冲液)的PCR反应管中，扩增40个循环，循环参数为37℃5min；95℃1min；60℃30s。定量结果采用计算对数平均值的方法来计算HBV-DNA平均拷贝数，遇有阴性结果，不参加平均值的统计。

2结果

200例乙肝标本中有91例HBsAg、HBeAg、抗-HBc阳性的标本中，FQ-PCR检测HBV-DNA全部阳性，阳性率100％，平均HBV-DNA拷贝数为2.8×106/ml。

3讨论

乙肝病毒血清标志物检测是目前诊断乙型肝炎最常用的指标，主要反映人体对乙肝病毒的免疫反应状态，不同血清标志模式反映不同的临床意义。近年采用TaqMan探针建立了荧光定量PCR技术，由原来的开放性鉴定改为封闭性自动仪器鉴定，大大减少了PCR检测过程中的污染，同时由于自动化程度的提高，也大大减少了人力物力的消耗。对当前的病原检测作出了卓越的贡献。在常见的5种肝炎病原中，由于病毒在机体存在的部位和时间不同，临床常用的检测技术各异，急性病毒性肝炎如甲型肝炎、戊型肝炎，进行核酸诊断的标本主要使用大便，但由于排毒时间较短，因此临床诊断的意义相对较小。而乙型肝炎和丙型肝炎由于慢性化的时间很长，并且血循环中的HBV和(或)HCV的含量与病情发展及预后关系密切，因此在病毒性肝炎的临床基因诊断中主要针对乙型肝炎和丙型肝炎，同时采用巢式PCR进行HCVRNA和HBVDNA的基因分型。

目前已较普遍地采用HBV-DNA定量测定，常用方法有荧光定量PCR检测、定量酶联杂交PCR检测等。荧光定量PCR检测的原理，为利用荧光染料在光刺激下释放的荧光能量的变化直接反映出PCR产物量的变化，荧光信号变量与经PCR扩增后的HBV-DNA产物量成正比，通过足够灵敏的自动化仪器实现对荧光的采集和分析，并通过校准品的校准曲线，来确定原始模板的含量。理论上无乙型病毒感染者为Ocopies/ml，不过该法的最低检测限度通常为200copies/ml。荧光定量PCR方法特异性强，灵敏度高，定量准确，定量范围为1×103～5×107copies/ml。自动化仪器全封闭反应的环境，极大地降低了假阳性的产生。

在使用荧光进行PCR定量时，荧光信号与产物模板数成一一对应的关系，检测荧光的信号就可以对PCR产物定量。但是，使用终点法测定的重复性并不好。由此PE公司于1996年发明了实时荧光定量PCR，监测每个循环的荧光强度，并使用Ct值进行分析，很快得到大家的接受，广为应用。当扩增越靠后定量的重复性就越差。主要是因为：①荧光定量技术要求在低浓度环境，因为荧光检测定量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立的，如果分子浓度高了，影响作用很复杂，而PCR扩增产物是高浓度的，因此重复性变差也很容易理解；②由于扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而产生不可控的影响。固定循环数后，荧光信号与模板数成正比，但当固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

大量临床标本测定结果证明，其特异性高，灵敏度可达0.01fg，相当于2.5个乙型肝炎病毒颗粒，荧光定量PCR对下列情况更具有独特的诊断价值：①治疗前进行病毒定量检测，可以指导选择抗病毒药物，避免盲目用药；②治疗后定量PCR直接准确Ⅷ测定体内病毒数量，有助于疗效的判断；③怀孕前进行定量PCR测定，有助于选择有利的怀孕时机。乙型肝炎孕妇进行定量PCR检查，有助于使部分患者得到及时的正确的诊断。就HBV定量技术而言，目前我国尚未建立分子杂交定量分析技术，现已报道的PCR定量分析法也属于低水平重复，今后有必要重视这方面的投资和开发。在临床研究领域应当有自己的立足点，不应简单重复国外研究结果。

参考文献

[1]李金明.聚合酶链反应临床应用的优越性和局限性[J]].中华检验医学杂志,2005,28(30):225.

[2]李金明.定量聚合酶链反应测定应用技术[J].中华检验医学杂志,2002,25(2):123.

[3]赖宏芳,付晓野,董玉琳等.荧光探针定量PCR检测HBVDNA[J].上海：上海医学检验学杂志，2000，15(1)：1819.