环介导等温扩增技术和实时聚合酶链反应检测痰结核分枝杆菌的优劣

环介导等温扩增技术和实时聚合酶链反应检测痰结核分枝杆菌的优劣

包维华

包维华（广西职业病防治研究院530021）

【摘要】目的通过罗氏固体培养法,对环介导等温扩增技术(LAMP)和实时聚合酶链反应(RT-PCR)检测痰结核分枝杆菌的优劣评价。方法选择临床经罗氏固体培养为阳性痰标本68份,阴性标本68份,分别采用LAMP和RT-PCR方法进行结核分枝杆菌检测结果，两者阳性检出率分别为88.2%.85.3%,两者差异没有统计学意义(P＞0.05);培养阳性标本经LAMP、RT—PCR检测结果灵敏度分别为91.2%和82.4%,两者差异没有统计学意义(P＞0.05);培养阴性标本经LAMP、RT—PCR检测结果的特异性分别为85.3%和88.2%,两者差异没有统计学意义(P＞0.05)。结论LAMP检测法阳性率高于RT-PCR法,但两者之间的差别尚无统计学意义,LAMP具有简单快速、准确,LAMP检测阳性标本灵敏度比RT-PCR好,LAMP检测阴性标本特异性稍低,LAMP具有简单、快速、准确,不需要昂贵的检验设备和严格的实验室设置，更适合基层结核病的实验诊断推广应用。

【关键词】PT-PCR技术LAMP技术结核分枝杆菌痰标本

我国是全球结核病高发国家之一,位距世界第二位[1]。结核病实验室诊断是我国实施结核病防治规划的重要组成部分。一种准确及时，简单快速的肺结核诊断方法对早期切断结核病传播，遏制结核病蔓延创造有利重要条件。结核病的诊断方法，目前主要是形态检验法，该法虽简单易行，但检出率低，不能特异鉴别是否结核分枝杆菌；分枝杆菌培养技术特异性、敏感性高，但耗时长，对及时诊断结核病和抗痨治疗错失良机。近年来，在聚合酶链反应（Polymerasechainreaction,PCR）基础上发展而来的环介导等温扩增法（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP），是由日本荣研株式会社的Notomi等[2]于2000年开发出来的一种新型核酸扩增方法。LAMP反应不需要昂贵的设备，有着广泛的应用前景[3,4]。本研究采用LAMP技术和RT-PCR（Real-time-PCR）方法对由常规培养鉴定为阳性和阴性痰样本进行检测结果评价。

1材料与方法

1.1标本收集收集2010年2月～9月到结核病防治院门诊就诊的疑似肺结核患者痰标本并留取经罗氏固体培养基培养鉴定确认的阳性标本68份，阴性标本68份。

1.2痰培养向痰标本加入4%naoH溶液处理20min,取0.1ml接种于酸性罗氏培养（BASO公司产品）斜面上，每份标本按2支培养基，置37℃培养箱培养4～8周并记录培养结果。

1.3DNA提取将液化后的痰标本混匀，在1.5ml离心管中移入0.5ml样本，15000rpm离心10分钟，弃去止清液，用无菌0.9%性理盐水1ml打匀，沉淀直接加50mlDNA提取液充分混匀，沸水浴10分钟，10000rpm离心5分钟，上清液为DNA模板。

1.4LAMP扩增扩增反应体系由广州华峰生物科技有限公司提供。LAMP针对靶基因区域的4条特殊引扬的设计和具有链置换活性的Bst(BacillusStearothermophilus)DNA聚合酶的应用。将一定量的DNA模板加入反应管中，置干垫恒温仪内65℃反应60min.反应结束后，试剂内的SYBRGreenI染料结合，如有扩增产物，与染料结合而呈绿色，肉眼直接判读结果。

1.5实时荧光核酸扩增（RT-PCR），试剂由广州达安基因股份有限公司生产的结核分枝杆菌酸扩增荧光检测试剂盒，扩增仪为广州达安因股份有限公司生产的实时荧光核酸扩增仪（型号DA7600），按试剂盒方法进行检测。

1.6统计学分析两方法检测结果差异的显著性检验用配对设计McNemarX2进行分析。

2结果

2.1LAMP和RT-PCR方法对痰标本的阳性检出率分别有LAMP和RT-PCR对痰标本标本进行检测，阳性检出率分别为88.2%（120/136）。85.3%（116/136）。结果显示LAMP法稍高。经显著性检验，两种试验方法对痰结核分枝杆菌的检测结果之间的差别无显著性意义（X2=0.409,P>0.05）,详细结果见表1，表2。

表1LAMP、RT-PCR两种试验方法与培养法对痰结核分枝杆菌检测结果

2.2LAMP、RT-PCR检测结果的灵敏度和特异性培养阳性标本经LAMP、RT-PCR检测结果的灵敏度分别为91.2%（62/68）和82.4%（56/68）；LAMP检测结果灵敏度较RT-PCR高，但没有统计学意义（x2=2.31,p＞0.05）；培养阴性标本LAMP、RT-PCR检测结果特异性分别为83.3%（58/68）和88.2%（60/68），LAMP检测结果比RT-PCR稍低，两者没有统计学意义（x2=0.257,p>0.05）。详细结果见表3,表4。

3讨论

肺结核的诊断仍然以痰培养作为金标准。但痰培养存在耗时长、易污染、阳性率低，后期尚需要配合菌种鉴定才能做出诊断等缺点。痰涂片检测阳性率低，只能确认为抗酸杆菌，而痰培养往往非结核分枝杆菌也呈现阳性，容易在非结核分枝杆菌流行的地区出现误诊。LAMP检测的核心技术是针对基靶因6个区域的4条特殊引物的设计和具有链置换活性的BstDNA聚合酶的应用，与以往传统的核酸扩增方法相比具有以下特点：（1）等温扩增，整个反应都在65℃恒温体系中进行，（2）操作简单，不需用昂贵的仪器，不同于传统的PCR需要严格的实验室设置，一般实验室便可开展实验。（3）由于是针对靶序列6个区域的4条特殊引物，6个区域中任何区域与引物不匹配的均不能进行核酸扩增，故其特异性高。（4）高灵敏度，如将16SrRNA蛋白作为靶目标设计LAMP引物，其敏感度达到1pb基因DNA[5]，近年来，LAMP检测技术与其它技术结合如逆转录环介导扩增结合疫吸附杂交方法快速检测MTB标本的16SrRNA，可重复检测单一拷贝[6]；Hatano等[7]研究者在传统LAMP的基础上发明了可自由使用的袖珍加热装置LAMP法，只要保存于泡沫聚苯乙烯容器中，不论在4℃还是37℃的环境中，其最低检测限与传统LAMP没有区别，其最大特点不需要电器基础设施。

为了验证LAMP方法对临床痰标本检测的灵敏度和特异性，本研究分别采用来源于临床可疑肺结核患者的痰标本经罗氏培养鉴定为阳性结核分技杆菌68份，阴性68份，采用LAMP、RT-PCR两种方法进行了检测。结果显示，LAMP阳性检出率最高，LAMP法灵敏度优于RT-PCR，但LAMP法比RT-PCR特异性稍低，LAMP法与传统RT-PCR法比较，本研究认为LAMP试验优于RT-PCR试验，由于LAMP和RT-PCR分子生物学检测法对活菌或死菌的检测都呈现阳性结果，而常规培养法只有活菌才能培养阳性，这是导致分子生物学法与培养法结果不能完成一致的原因之一。

本文研究结果提示，LAMP检测痰结核分枝杆菌技术具有灵敏度高、特异性好、经济简便等特点，是一种快速检测痰标本结核分枝杆菌诊断试验，期望未来取代传统PCR法，更适合条件简单的基层实验室推广应用。

参考文献

[1]WHO.Lnterimpolicycollaborative结核/HIVactivities.Geneva:WHO,204:330.

[2]NotomitOkayamaH,MasubuchiH,etal.loop-mediatedisothermalamplificationofDNA[J].NucleicAcidsRes,2000,28(12);63—69.

[3]MoriY,NagamineK,TomitaN,etal.Detectionofloop-mediatedisothermalamplificationreactionbyturbidityderivedfrommagnesiumpyrophosphateformation[J].BiochemBiophysRescommun,2001,289(1):150—154.

[4]肖斌，朱永红，邹全明.简便敏感的环介导等到温扩增基因诊断技术[J].中华检驸医学杂志，2005，28（7）：761—763.

[5]ZhuRY,ZhangKX,ZhaoMQ,ETal,Useofvisualloop-mediatedisotheralamplificationofrimmsequenceforrapiddetectionofmycobacteriumtuberculosisandmycobacteriumbovis[J].JMicrobiolMefhods,2009,78(3):339-343．

[6]LeeMF,ChenYH,PengCF,Evaluationofrevrsetranscriptionloop-mediatedisothermalamplificationinconjunctionwithELISA-hybridzationassayformdeculardetectionofMycobacteriumtuberculosis[j].JMicrobolMethods,2009,76(2):174—180.

[7]HatanoB,MakiT,ObaraT,etal.LAMPusingdisposablepocketwarmerforAnthraxdetection,ahighlymobileandreliablemethodforAnti-Bioterrorism[J].jpnjInfect.Dis,2010,63(1):36—40.