葡萄球菌肠毒素A诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的荧光检测

葡萄球菌肠毒素A诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的荧光检测

杨志涛王登秀

（1遵义医药高等专科学校临床系贵州遵义563006）

（2遵义市红花岗区疾病预防控制中心预防医学门诊贵州遵义563000）

【摘要】目的：探讨葡萄球菌肠毒素A（SEA）诱导肝癌细胞HepG2凋亡的作用。方法：采用荧光法观察SEA诱导HepG2细胞凋亡的形态学变化。结果：荧光显微镜下可见细胞出现体积缩小，核碎裂，染色质凝集等凋亡形态改变。结论：SEA可诱导HepG2细胞凋亡。

【关键词】HepG2；细胞凋亡；吖啶橙

【中图分类号】R37【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）32-0028-02

AfluorometricmethodonSuperantigensininducingtheapoptosisofhumanhepatocellularlivercarcinomacellline(HepG2)invitro

YangZhitao1,WangDengxiu2.1.ZunyiMedicalandPharmaceuticalCollegeClinicaldepartment,Zunyi563006,China;

2.DepartmentofPreventiveMedicine,Honghuagangdistrictcenterfordiseasecontrolandprevention563000,China

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheinducingeffectofSEAontheapoptosisHepG2.MethodsAfluorometricmethodwasusedtoobservethemorphologicalchangesofcellapoptosis.Resultscellswereseenunderfluorescentmicroscopeshrinkagenuclearfragmentation,Chromatinmorphologicalchangesofapoptosis.ConclusionsExperimentsshowedthatSEAcaninducetheapoptosisofHepG2cells.

【Keywords】HepG2;Apoptosis;Acridineorange

原发性肝癌是临床最常见的消化道恶性肿瘤之一[1]，在癌症致死因素中位居第三位[2]。肝癌的手术治愈率低，术后5年生存率为14％[3]。近年来，人们尝试用生物免疫疗法治疗原发性肝癌取得了一定的成果。根据研究显示，原发性肝癌的产生、发展和转归与肝癌细胞的凋亡有着密切的关系[4]。为此，本实验尝试用金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）来诱导肝癌细胞凋亡。

1.材料与方法

1.1材料与仪器

肝癌细胞HepG2（遵义医学院中心实验室）；SEA（北京诺必信生物工程有限公司），使用前稀释到所需浓度；丫啶橙（天根生化科技（北京）有限公司）；荧光显微镜（Olympus）；二氧化碳培养箱（ThermoForma公司）。

1.2方法

1.2.1细胞培养HepG2复苏后，在DMEM培养液（含10%的胎牛血清），37℃，5%CO2培养箱中培养，选对数生长期的细胞进行试验，分对照组和SEA组，按2:1，每三天传代。

1.2.2HepG2细胞凋亡的荧光法观察将对数生长期的HepG2细胞常规传代，待细胞贴壁后换液继续培养24h，加入SEA,使其最终质量浓度为0.2μg/ml，作用24h后，胰酶消化，制成细胞悬液，调整细胞数为107个/ml。取90μl细胞悬液，并加入新鲜配制的丫啶橙溶液10μl充分混匀，取1滴细胞混合液滴在干净的载玻片上，用盖玻片封片，注意不要有气泡，在荧光显微镜下观察，并拍片。

2.结果

SEA诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的形态学观察没有加SEA作用的对照组细胞，荧光显微镜下观察为均匀的绿色，形态比较规则（图1）；加SEA作用的细胞，有大有小，凋亡细胞大多可见细胞核形态不规则，胞质浓缩，核固缩、碎裂，细胞边缘处出现大小不等的圆形或不规则的荧光颗粒（图2，3）。

图1对照组HepG2细胞荧光情况（×100）

图2、30.2μg/mlSEA处理组HepG2细胞荧光情况（×100）

3.讨论

肝癌的发生既与肝细胞增殖和分化的异常有关，也与细胞凋亡异常有关[5-6]。SEA是一种不需要抗原递呈，只要极低浓度便能直接引起高效免疫活性的蛋白质[7]，使其用于诱导肿瘤细胞凋亡的研究比较多[8-9]，但用于肝癌的研究还鲜见。

凋亡有着显著的形态学特征，吖啶橙是一种荧光色素，该色素具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒。本实验用吖啶橙染色，在荧光显微镜下观察到，通过SEA作用后的细胞和对照组细胞比较，体积变小，胞核边界不规整，核固缩、细胞核碎裂等，这些均为典型的细胞凋亡现象。

本研究显示，SEA可诱导体外培养的人肝癌细胞HepG2凋亡，其诱导凋亡的机制有待进一步探讨。

【参考文献】

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[2]赵平，孔灵芝．中国肿瘤死亡报告(2004-2005)[M]．北京：人民卫出版社，2010:3-45.

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[6]Parkjh,Yoonjh,Kimsaetal.(-)-Epigallocatechin-3-gallateinhibitsinvasionandgrationofsalivaryglandadenocarcinomaells[J].OncolRep,2010,23(2):585-590.

[7]韩乃寒,刘映,赵燕英,等.金黄色葡萄球菌肠毒素研究进展.[J]现代生物医学进展，2015,15(1):181-187.

[8]LeroyEM，BecquartP，WauquierN，eta1．EvidenceforEbolaVirusSuperantigenActivityJJournalofVirology,2011，85(8)：4041—4042．

基金项目：遵义市科技局课题（遵市科合字[2012]28号）。