高氧肺损伤中TGF-β/smad信号通路相关蛋白的表达及意义

高氧肺损伤中TGF-β/smad信号通路相关蛋白的表达及意义

杨军廖志勇巨容

杨军廖志勇巨容(成都市妇女儿童中心医院PICU四川成都610000）

【摘要】目的：检测转化生长因子TGF-β/smad信号通路相关蛋白在高氧肺损伤中的表达，探讨其与基因LKB1表达的相关性。方法：40只3日龄新生大鼠依据是否高浓度氧暴露随机分为二组：正常对照组（空气环境下暴露7天）和高氧组（95%氧暴露7天）；实验结束后留取肺组织标本，光镜观察并盲法评分，免疫组化法检测肺组织LKB1、TGF-β1、psmad2蛋白的表达和分布，比较两种组织表达程度的差异。结果：与正常对照组相比，高氧组中的LKB1、TGF-β1、psmad2蛋白均有降低，LKB1、TGF-β1蛋白表达差异有显著性P<0.05，psmad2蛋白表达差异无显著性，高氧组肺组织中，LKB1与TGF-β1蛋白表达呈正相关，有统计学意义(r=0.474，P=0.04)，TGF-β1与psmad2蛋白表达呈正相关，有统计学意义(r=0.491，P=0.033)。结论：高氧肺损伤中，TGF-β/smad信号通路可能受到LKB1的分子调控，TGF-β/smad信号通路可能参与高氧导致的肺损伤发生。

【中图分类号】R563.9【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）08-0021-02

尽管急性肺损伤（ALI）的发病机制尚未完全阐明，但由细胞、细胞因子和炎症介质构成的调节网络的失控，导致肺内皮细胞与肺泡上皮细胞为主的靶细胞受损已被广泛认同[1]。LKB1基因是一种抑癌基因，TGF-β/smad信号通路在维持正常上皮的发生发展过程中具有重要作用，本文拟研究TGF-β，psmad2蛋白在高氧肺损伤中的表达，并结合LKB1蛋白探讨此通路与高氧肺损伤发生的关系，为高氧肺损伤的研究提供新的思路。

1材料和方法

1.1实验动物和分组40只3日龄SD大鼠,性别不拘,购自四川大学华西医院实验动物中心，随机分为空气组、高氧组，每组20只。

1.2新生大鼠高氧肺损伤模型制备及干预按本实验室方法制作新生大鼠高氧肺损伤模型[3]，自制塑料容器为氧箱，以测氧仪（CY-100数字测氧仪，浙江省建德市利达仪器厂）控制氧浓度。容器内放入石灰以吸附二氧化碳，箱内温度22-30°C，湿度65-75%。实验前称重，高氧组于95%氧浓度连续暴露7d，而对照组置同一室内空气中，为避免母鼠氧中毒影响新生鼠生长，高氧组母鼠与空气组每24小时互换。全部大鼠均于日龄10d时称重及量身长后处死，快速剪开胸腔，取出双侧肺脏，肉眼观察后，生理盐水冲洗。

1.3方法所有标本经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，切片脱蜡至水，微波修复，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，滴加一抗，4℃过夜，滴加辣根酶标记IgG多聚体，DAB显色，复染，中性树胶封片，用PBS代替一抗为阴性对照，LKB1单克隆抗体、TGF单克隆抗体购自Santacruze公司，psmad2抗体购自Millipore公司，即用型免疫组化广谱试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司

1.4结果判断每张切片随机选取5个不同高倍视野(×400)观察，每视野计数100个细胞，阳性细胞百分数<5%为阴性(-)，5%～25%为弱阳性(+)，25%～75%为阳性(++)，>75%为强阳性(+++)。

1.5统计学处理应用SPSS13.0统计软件进行分析，等级资料的差异性检验采用两个独立样本比较的秩和检验进行<0.05，为有显著性差异，用偏相关分析高氧肺损伤组织中LKB1，TGF-β1及psmad2蛋白表达的相关性。

2结果

2.1免疫组化结果

LKB1蛋白定位于肺泡上皮细胞胞质，TGF-β1蛋白定位于间质组织及肺泡上皮细胞胞质，psmad2蛋白定位于肺泡上皮细胞胞核（图1）。在高氧组和正常对照组肺组织中，经Mann-Whitneyu检验，高氧组LKB1蛋白平均秩为17.08，正常对照组为23.93，Z=-2.026，P=0.043，二者有显著性差异；高氧组TGF-β蛋白平均秩为17.03，正常对照组为23.98，Z=-1.978，P=0.048二者有显著性差异；高氧组psmad2蛋白平均秩为19.50，正常对照组22.58，Z=-1.978，P=0.392，二者无显著性差异（表1）。

实验组中LKB1，TGF-β1，psmad2蛋白的表达

2.2组织中，LKB1与TGF-β1，TGF-β1与psmad2表达的关系LKB1表达与TGF-β1表达呈正相关(r=0.474P=0.04)，TGF-β1表达与psmad2表达呈正相关(r=0.491,P=0.033)，LKB1与psmad2蛋白表达相关关系不显著(r=0.169，P=0.488)，详见表2。

3讨论

本组研究发现在高氧暴露下，大鼠体重下降，身长减少，肺组织RAC值降低，表明高氧导致大鼠生长发育受限，肺组织发育受损。

TGF-β/smad信号通路可抑制上皮细胞过度生长，在上皮间质转化的过程中起重要作用，另一方面其信号通路又参与促进血管生成，促进侵袭及转移的恶性机制，已发现人类TGF1，2，和3三种亚型，其中，TGF1是在人体中发现最多和研究最集中的一种亚型，为分泌蛋白，多存在于间质中。TGF-β与肺组织细胞膜上的受体结合，将活化的信号传递至细胞内，细胞内Smad2、3磷酸化将信号传人细胞核内，激活核内转录蛋白STAT-1，启动胶原蛋白mRNA的转录，合成胶原蛋白[2]。此外，TGF-β还抑制肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC2)的增殖、分化而导致新生鼠肺发育受阻；同时还可抑制胶原酶、弹性蛋白酶、基质金属蛋白酶等的活性，减少细胞外基质(ECM)降解，使ECM沉积增多，引起。

转化生长因子(transforminggrowthfactorβ,TGF-β)通路主要由TGF-β配体、I型II型受体和smad蛋白介导。TGF-β结合其受体并使之激活,激活的受体促进smad复合体形成和入核,从而调控特定基因的转录。目前认为TGF-β通路可促进细胞增殖,也可抑制细胞增殖,而这主要依赖于所处细胞环境[3]。在正常上皮细胞中,TGF-β起抑制增殖作用。LKB1条件敲除的小鼠中,间充质细胞TGF-β分泌减少,导致上皮细胞过度增生[4]。血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是控制血管新生的信号因子,其正常调控在胚胎发育和低氧应激中有重要意义。研究表明,LKB1可以调节VEGF的水平。LKB1敲除的老鼠胚胎期即死亡,并伴随血管发育异常和VEGF表达量的明显上调,而且,过表达LKB1可下调VEGF的水平[5]。

对条件性敲除LKB1，基因的转基因小鼠研究表明其胃肠道平滑肌细胞特异性，LKB1信号缺失导致胃肠道间质细胞分泌的TGF-β1蛋白减少，不能维持上皮正常增殖。本研究结果表明与正常肺组织相比，高氧肺损伤组织中的LKB1，TGF-1psmad2蛋白均有降低，LKB1，TGF，1，差异有显著性<0.05，psmad2，蛋白表达差异无显著性，实验组肺组织中LKB1与，TGF-β1蛋白表达呈正相关，r=0.474，p=0.04，TGF-β1与psmad2蛋白表达呈正相关(r=0.491,P=0.033)，提示LKB1缺失间质中，TGF-β1分泌降低，引起TGF/smad信号通路下游激活状态的psmad2蛋白减少，信号传递不能维持上皮细胞的正常生长，出现上皮细胞过度生长，发生纤维化。

现在越来越多的意见认为高氧肺纤维化根本问题是肺泡上皮在急性炎症损伤后不能正常修复，在修复过程中不是由正常肺泡上皮细胞代替，而是由成纤维细胞替代[6]。有报道在高氧暴露3h后肺组织TGF-β水平就开始升高，同时受TGF-β刺激而增生的成纤维细胞也可产生大量的TGF-β。以上提示间质-上皮相互作用能够维持上皮细胞生长，而数据库蛋白间相互关系的分析也得出，LKB1与TGF蛋白之间的相互作用，另外LKB1调节AMPK及其家族成员，LKB1是磷酸化激活AMPK家族的主要的上游激酶，通过AMPK苏氨酸残基磷酸化循环激活，AMPK及相关家族共14个激酶成员，包括AMPK1，AMPK2，BRSK1BRSK2，Nuak1，Nuak2，MARK1-4，QSK，QIK，SIK，及SNRK，研究表明，SIK可以负向调控TGF通路，间接指出LKB1，与TGF通路的相互关系，然而LKB1与TGF蛋白相互作用的具体机制仍不明确，需进行进一步研究

参考文献

[1]DerynckR,AkhurstRJ,BalmainA.TGF-betasignalingintumorsuppressionandcancerprogression.NatGenet,2001,29(10):117-29.

[2]KatajistoP,VaahtomeriK,EkmanN,etal.LKB1signalinginmesenchymalcellsrequiredforsuppressionofgastrointestinalpolyposis..NatGenet,2008,40(4):455-9.

[3]RobertsAB.IsSmad3amajorplayerinsignaltransductionpathwaysleadingtofibrogenesis?Chest，2001，120(Suppl.1)：43S.

[4]MaqiSO’KellyCJ，LeungWI，eta1.Timingofhyperoxicexposureduringalveolarizationinfluencesdamagemediatedbyleukotrienes[J].AmJPhysiolLung-CellMolPhysiol，2001，281(4)：L799.