(江西卫生职业学院江西南昌330052)
【摘要】目的:通过MTT法检测羟基脲衍生物的体外抗肿瘤活性,筛选出有体外抗肿瘤作用的羟基脲衍生物。方法:选用Hep-2肿瘤细胞作为模型,然后利用MTT法从六种羟基脲衍生物中筛选出对Hep-2肿瘤细胞有抗肿瘤作用的,并计算其对Hep-2细胞的半数抑制浓度,即IC50值。结果:筛选得到对Hep-2细胞有很好的抗肿瘤活性的衍生物有3种。计算得到的每种羟基脲衍生物对Hep-2细胞的半数抑制浓度IC50值。结论:HY-CN、HX-CN和HX-叔对Hep-2细胞有非常好的抗肿瘤作用。
【关键词】羟基脲衍生物;MTT;IC50
【中图分类号】R97【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2016)01-0178-02
MTT法被广泛用于大规模抗肿瘤药物的体外筛选[1]和肿瘤放射敏感性的测定等[2]。本实验选用Hep-2细胞进行羟基脲衍生物的体外抗肿瘤活性筛选。
1.实验材料、试剂与仪器
人喉癌上皮细胞Hep-2细胞株(南京凯基生物科技发展有限公司)。
各种自制羟基脲衍生物:2.4-二氯苄氧基脲(HX-Cl);4-氰苄氧基脲(HX-CN);4-硝基苄氧基脲(HX-NO2);4-叔丁基苄氧基脲(HX-叔丁基);N-(2.4-二氯苄基),N-(2.4-二氯苄氧基)脲(HY-Cl);N-(4-氰苄基),N-4-氰苄氧基)脲(HY-CN);阳性对照药物:羟基脲(上海达瑞精细化学品有限公司批号20100612)。阴性对照:含5%的胎牛血清1%二甲亚砜RPMI-1640培养基。RPMI-1640培养基(美国Hyclone试剂公司);胎牛血清(杭州四季青工程材料有限公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT)。680型酶联免疫检测仪(BIO-RAD公司);96孔培养板(美国Costar)。
2.方法(MTT法)
(1)调整Hep-2细胞的浓度为5×104个/ml左右,以100μL/孔接种于96孔板中,每组浓度设置5个复孔,同时设对照组、空白组。
(2)将配制好的各浓度的受试羟基脲衍生物和对照物以100μL/孔接种于96孔板中,空白对照组以100μL/孔加入药物稀释液。
(3)将96孔板置于37℃,95%空气和5%CO2培养48h后,每孔加MTT(5g/L)20μL。
(4)继续孵育已加药的Hep-2细胞4h,小心地用枪吸弃孔内的150ul培养液,然后每孔加入150ulDMSO。完成后,将96孔板放置在酶联免疫检测仪的凹槽上,开启酶联免疫检测仪和电脑,用电脑设置波长及震荡10min,使结晶充分地溶解,最后在酶联免疫检测仪490nm处测得各孔的吸光值。
(5)选用空白对照组调零,在波长为490nm处,用酶标仪测定各孔吸光值,计算得细胞生长抑制率,当抑制率≥30%时,细胞对该药敏感。
(6)细胞生长抑制率的计算公式:细胞生长抑制率(%)=(1-给药组/空白对照组)×100%
(7)重复实验2次。
3.实验结果
羟基脲衍生物作用于Hep-2细胞48h,然后用酶联免疫检测仪,测出甲臜溶液OD值。最后,根据Hep-2肿瘤细胞生长制率公式和IC50计算公式,将所得到的OD值用Excel2003进行计算,结果见表1。部分羟基脲衍生物对Hep-2细胞的生长抑制率比对照药物羟基脲的抑制率更加高,有的甚至高达90%以上,如羟基脲衍生物HY-CN。从IC50上看,羟基脲衍生物HY-CN、HX-CN、HX-叔、YB4均比羟基脲的低,证明它们的抗肿瘤细胞Hep-2活性都较强。
以受试羟基脲衍生物浓度作为横坐标,生长抑制率作为纵坐标,分别绘制各羟基脲衍生物作用于Hep-2细胞的生长抑制曲线,羟基脲衍生物对Hep-2细胞的生长抑制率呈正向关系,有浓度依赖。
选用SPSS18.0软件对生长抑制率进行t检验,得P<0.05,因此各羟基脲衍生物和羟基脲对Hep-2细胞的抑制率有显著的差别。
4.讨论
结果证明,部分羟基脲衍生物抗肿瘤活性优于羟基脲,有三种羟基脲衍生物对Hep-2细胞有较好的抗肿瘤活性。在高浓度时,部分羟基脲衍生物对肿瘤细胞的抑制率达到90%以上。这可能是由于羟基脲衍生物脂溶性比羟基脲更强,从而进入细胞内的药物浓度更高,能够更好地和药物靶点结合,提高羟基脲衍生物的生物利用度,因而发挥出更强大的细胞毒性作用,最后诱导肿瘤细胞凋亡。
【参考文献】
[1]吴慧.抗肿瘤药物体外筛选方法[J].医学理论与实践,2005,18(2):146-148.
[2]秦婷婷,唐东平.MTT方法体外应用新进展[J].现代肿瘤医学,2008,16(10):1835-1837.