HBV感染患者外周血单个核细胞HBV DNA和cccDNA的检测

HBV感染患者外周血单个核细胞HBVDNA和cccDNA的检测

江政松童金凤刘晓峰

九江市第一人民医院江西九江332000

摘要：目的：分析HBV感染患者外周血单个核细胞（PBMC）能否感染HBV并进行复制。方法：选取140例2016年7月-2017年7月在我院住院的患者，对本组患者的血液进行采集，在血液样本中分离提取PBMC，用固定甩片法固定细胞，用实时荧光定量聚合酶链式反应技术（QPCR）联合滚环扩增结合原位跨缺口原位聚合酶链式反应技术对HBVDNA进行检测；用免疫组织化学染色法检测HBVDNA和cccDNA的表达。结果：在140例标本中，有95例标本中检测出了HBVDNA的表达，有116例标本中滚环扩增（PCR）结合原位杂交后检测出了HBVcccDNA的阳性信号，血清HBVDNA的浓度在106copies/ml以上的患者外周血单个核细胞中外周血单个核细胞中HBVcccDNA的阳性率为103例（73.57%），而血清HBVDNA浓度低于106copies/ml的阳性率为37例（26.43%）。结论：HBV感染患者外周血单个核细胞受到感染的危险因素是高浓度外周血HBVDNA和cccDNA，采用原位聚合酶链式反应技术能够更加准确的检测出HBV感染患者外周血单个核细胞（PBMC）中HBVDNA和cccDNA的表达。

关键词：HBV感染；外周血单个核细胞；HBVDNA；cccDNA；检测

HBV的感染是一个世界性的话题。经过统计，全球曾经感染过HBV的人数超过了20亿人，并且目前还有2.5亿人为慢性HBV患者，而我国慢性HBV患者就超过了2000万人。很多新生儿期感染上HBV以后，有80%～95%的患者都转化成了慢性HBV感染患者，此类患者在成年后极易发展成肝癌或者肝硬化，最终死亡[1]。虽然我国现在已经实施了新生儿乙肝疫苗接种策略，也有效的控制住了乙肝的流行，但是由于很多母婴传播的并不能完全通过乙肝疫苗的预防，因此，也还是面临着一些挑战。为了进一步了解HBV是否能够感染PBMC以及其在PBMC中存在的形式和位置，本次研究中采用了PCR技术和原位PCR技术对PBMC中的HBV进行检测。

1资料与方法

1.1一般资料

选取140例2016年7月-2017年7月在我院住院的患者，对本组患者的血液进行采集，本组患者中男89例，女51例，年龄22～56岁，对本组患者进行乙肝五项检查和HBVDNA检查，经过检查，确证为慢性乙肝患者85例，非乙肝患者55例。

1.2方法

1）外周血单个核细胞（PBMC）的分离提取和固定采用蔗聚糖密度梯度离心法，将淋巴细胞分离液与血液标本置于10ml的离心管中，将圈数设置为920r，离心时间设置为25min，将离心管中云雾状的白膜层进行收集，用磷酸缓冲盐溶液进行洗涤后，依次进行重悬细胞并计数。而后利用甩片机将细胞固定在粘附载玻片上，晾干后用浓度为4%的多聚甲醛进行固定，放在4℃的冰箱中国将其干燥保存[2]。

2）HBVcccDNA荧光定量检测采用血液基因组提取试剂盒把提取出来的PBMC细胞中的DNA提取出来，然后利用DNA酶进行处理，先进行滚环扩增，通过荧光剂定量PCR方法对cccDNA的表达情况进行检测[3]。

3）HBVDNA和cccDNA的原位检测采用地高辛标记的引物，采用原位PCR技术对HBVDNA进行检测，再采用联合滚环扩增结合原位跨缺口原位技术对cccDNA进行检测。经过染色试剂盒详细观察扩增产物的表达情况[4]。

1.3统计学分析

将收集到的140例住院患者的资料录入本院的EpiData3.1数据库系统，用SPSS22.0软件对检验期间所有的数据进行处理，计数资料用比率或者构成表示，用χ2检验，以α=0.05为检验水准。

2结果

2.1本组研究对象中，血清HBVDNA阳性有例，占%，HBsAg阳性有例，占%。乙肝E抗原阳性有例，占%，其中103例患者血清HBVDNA浓度高于106copies/ml，有37例患者血清HBVDNA浓度低于106copies/ml。利用荧光定量PCR技术在对HBVcccDNA检测中发现，有117例患者为阳性，23例患者检测为阴性。

2.2HBVDNA和cccDNA的表达情况140例研究对象中，有95例检测出了HBVDNA阳性，检出率为67.86%，有116例检出了cccDNA阳性，检出率为82.86%，有87例患者为HBVDNA和HBVcccDNA双阳性。由于在PBMC中不仅能够检测到HBVDNA，还能够检测到HBVcccDNA，也就说明了HBV可以在PBMC中复制。

2.3HBVcccDNA的检测结果与HBVDNA的关系通过此次研究后发现，外周血HBVDNA越高，在PBMC中检测到的cccDNA的阳性率就越高。103例血清HBVDNA浓度高于106copies/ml的研究对象中HBVcccDNA的阳性有93例（90.29%），有37例血清HBVDNA浓度低于106copies/ml的研究对象中HBVcccDNA的阳性有19例（51.35%），差异明显，有统计学意义。

3讨论

HBVcccDNA是乙肝病毒复制的重要标志之一。有相关研究发现有一部分HBsAg阳性肝癌患者外周血细胞中存在着HBVDNA，也有一些研究人员在乙肝患者和没有症状携带的外周血细胞中均检测到了HBVDNA，但是阳性率的差别比较大。也有相关研究人员发现，乙肝患者与正常人的免疫功能是有差别的。HBV会影响外周血细胞中的分泌能力，其可能是与HBV的复制情况有关系[5]。

目前，对于HBV到底能否感染PBMC，很多研究人员所得出的结论都各不相同。但是在本次研究中不但在PBMC中检测出了HBVDNA和cccDNA，而且还对HBVDNA和cccDNA所存在的位置进行了定位，也就进一步证实了HBV不但可以感染PBMC细胞，还可以在其中进行复制。这一结果也为进一步研究HBV的母婴传播机制提供了思路。这项研究结果具有非常重要的意义。

参考文献：

[1]刘畅，钟彦伟，徐元勇等HBV感染患者外周血单个核细胞HBVDNA和cccDNA的检测[J].中华疾病控制杂志，2016，20（09）：888-892.

[2]张鑫，黄凌鹰，周振华等慢性HBV感染者血清IL-15和外周血iNKT细胞水平变化及相关性研究[J].胃肠病学和肝病学杂志，2017，26（09）：1016-1021.

[3]杨新星，李东升，周继光等乙肝病毒感染不同阶段抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞的初步研究[J].中国免疫学杂志，2016，32（10）：1496-1502.

[4]陈旭丹，刘琼，李新华，谢冬英.慢性HBV感染者HBV特异性CD8~+T细胞Tim-3和PD-1的表达水平及其与IFN-γ产生的相关性研究[J].中华实验和临床感染病杂志（电子版），2013，7（05）：665-669.

[5]欧松，孙克伟，彭建平等补肾解毒方与健脾解毒方含药血浆对慢性乙肝病毒感染不同免疫状态患者外周血树突状细胞功能的影响[J].中国中西医结合杂志，2013，33（02）：208-213.