布鲁氏菌的血清学检测方法

布鲁氏菌的血清学检测方法

张国庆1.2新燕1韩敏2

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布鲁氏菌病（简称布病）是一种人兽共患的传染病，世界范围内流行。布病给人造成了大量损失和痛苦。近年由于布病的散发病例的增多，患者多无明确接触史，临床症状又不典型，因此其实验室检测至关重要。目前布氏菌的实验室检测主要分三类：布氏菌细菌学检测、血清学检测和分子生物学检测。细菌学检测周期长、阳性率低、感染风险高等特点，分子生物学对仪器、人员、技术的要求较高使得这两类技术在临床诊断应用上不是很普遍，应用最多的还是布氏菌的血清学检测。本文现就布氏菌的血清学的检测进行如下综述。

布氏菌血清学方法可以分为：凝集法、补体结合法、酶联免疫吸附试验法、荧光偏振法、胶体金层析法等。其中凝集法是通过特异性抗体与颗粒性抗原结合产生凝集的血清学实验，现应用最多的为虎红平板凝集实验、试管凝集实验、二巯基乙醇试管凝集实验、抗人球蛋白抗体实验等。

虎红平板凝集实验（RBPA）其抗原系用抗原性良好的牛种布氏菌株在适宜培养基上培养收获菌体,经加热灭活,离心后用虎红染料染色,悬浮于乳酸缓冲液（PH3.6-3.7）制成。它能抑制非特异性反应的IgM和增强特异性IgG的活性,其反应敏感稳定,特异性优于试管凝集实验。因此PBPA在很多国家推广使用,是我国常规的诊断方法之一。RBPA操作简单，不需要大型精密的仪器，适合基层医疗机构和检测点应用。因有很高的灵敏性且能在短时间内完成，RBPA常用于初筛实验。其有很高的准确性，特别是当检测1:4稀释血清标本阳性时其诊断的特异性更高【1】。但RBPA也有局限性，纤维蛋白原可与虎红染料发生非特异性结合形成假阳性【2】，急性病人早期，体内产生的抗体以IgM为主，RBPA可能检测为阴性。

试管凝集实验(SAT)又称莱特试验是1897年由Wright发明，其方法简便，特异性强，可半定量检布鲁氏菌抗体滴度，因此有很高的诊断价值，至今在临床上广泛使用。我国布病诊断标准中当SAT滴度≥1：100可确诊是活动性布病。SAT在临床中能相对准确的反应病情的变化，在疾病的潜伏期时SAT滴度常≤1：100，当患者出现发热等体征后滴度急剧上升，经过治疗后滴度又会降低，常用于布病的临床治疗和病情的监测。但SAT也会由于布氏菌发生了变异或抗体过高发生前带现象而使检测结果呈假阴性，该方法还与结肠耶尔森菌O:9产生的抗体以及体内某些自身抗体发生假阳性。也有临床上布病已经治愈，但两三年后SAT滴度依然很高【3】，所以SAT结果应结合其他结果以及患者的临床症状综合分析。

二巯基乙醇试管凝集实验（2-ME）是通过化合物中的巯基使大分子的IgM抗体的双硫键破坏，IgG抗体不受影响，所以2-ME实验主要检测的是布病患者血清中的IgG。该方法主要用于鉴别人工免疫及自然感染，在一定程度还可以排除某些与布病有交叉反应的疾病。我们认为在布病的急性期或慢性感染的活动期体内以IgM为主，而在慢性感染的非活动期或接种疫苗的机体中以IgG为主，2-ME是区分二者效果较好的实验。但2-ME操作与SAT一样较为繁琐，不适合布病的大规模筛查。

抗人球蛋白抗体实验（coombs’test）又称不完全抗体实验，在一些特殊或复杂的布病患者机体中查不到完全抗体的存在，可通过检测布鲁氏菌的coombs’test实验阳性而确诊,是SAT实验的一个补充。国家标准中认为coombs’test滴度≥1:200可确诊布鲁菌感染。半抗体检测主要是IgG、IgA的不完全成分，其检测结果与疾病的机体状态、病程所处时期、治疗效果都有一定关系。对特殊或复杂的布病的诊断很有意义。但该实验要求对检测标本做反复洗涤，操作复杂，时间长，而且还要有一定的设备，所以不适合大批量标本的检测。

补体结合实验（CFT）在国际贸易中被指定用于羊、牛、绵羊附睾种的布鲁氏菌的确诊实验，其原理是根据布鲁氏菌的抗原抗体反应消耗补体从而不能使指示系统（绵羊红细胞和溶血素）产生溶血而设计的。其检测的特异性强，有国际标准，方便各国操作，所以受到各国贸易的青睐。我国也把CFT作为人布病的诊断标准之一，但由于其操作复杂，所要求试剂种类多，敏感性不高，对实验人员和设备均有一定的要求，所以临床上应用不多。

酶联免疫吸附试验（ELISA）自1976年Cavleson最先把这项技术运用到检测牛布病抗体以来，ELISA方法以其高灵敏、高特异、操作简便且可大批筛查得到了人们认可。该方法主要分间接法（i-ELISA）和竞争法（c-ELISA），二者各有其特点。i-ELISA法敏感性较高，c-ELISA法则特异性更好。ELISA法与与CFT检测效果相当，但操作更方便且可检测血清和乳汁，2004年该法作为国际贸易中牛种和猪种布氏菌的指定试验。ELISA法检测布氏菌抗体的能力取决于反应孔中所包被的抗原成分，目前包被抗原的主要为光滑型羊型布氏菌的外膜脂多糖（LPS）中的O链。所以用S-LPS包被的ELISA法主要检测光滑型的布鲁氏菌，而对粗燥型的布氏菌检测能力不足。此外由于S-LPS与结肠耶尔森菌、伤寒等革兰阴性菌中的抗原相近，存在交叉反应，但随着抗原纯化技术的提高已逐步消除了交叉反应。至于用布氏菌的基因纯化细胞外膜蛋白（OMP）作为包被抗原一直是研究的重点，但纯化的OMP抗原制成的ELISA试剂检测能力仍不够理想，或许将来能有所突破吧。近年文献报道ELISA法检测的敏感性、特异性上的能力均要好于传统凝集法，特别是ELISA法检测布氏菌IgG、IgM联合应用更对疾病诊断有很好的效果【5-6】。我国对布氏菌抗体ELISA法研究也很多，也取得了好的预期效果，但国产ELISA试剂盒目前做的还不好，较为满意的试剂盒均来自国外。

荧光偏振分析（FPA）是近些年在发达国家常使用的一种检测方法，其根据布氏菌抗体与抗原结合的复合物较单独的抗原、抗体分子在液体中的转动速度慢，当给抗原或者抗体标记上荧光后，如果抗原抗体结合分子变大，转动速度慢使荧光偏振的信号变大的原理设计而成的。此法操作简单，有很好的敏感性和特异性，可通过仪器自动完成，能做大批量的筛查和确诊。CallD等在2000年将FPA应用于牛种布氏杆菌的检测，其检测结果与传统血清学凝集实验结果相比较，认为该检测方法较稳定。目前该方法在国内应用还未见报道。

胶体金免疫层析法(IGCA)是新发展的一种快速的诊断技术，因其有简便快捷特点而备受关注。其原理是以硝酸纤维素膜作为载体，以胶体金标记蛋白为显示剂，使得抗原抗体结合可在载体膜上显色。近些年IGCA应用到布鲁氏菌抗体诊断上的效果在国内外的文章有许多。Smits等使用了分别检测布鲁氏菌IgM、IgG抗体的胶体金层析板，其联合敏感度和特异性可达96%、99%，可检测急性以及慢性布病患者[7]。而我国程婷婷等使用纯化的外膜蛋白作为抗原建立的快速检测布病的IGCA与RBPA法符合率达92%，且与其他相似疾病无交叉反应[8]。虽然大量文献证明了IGCA是一种准确性好且便捷的方法，但该方法在国内用于临床诊断的还不多，仅见个别报告。

综上布病血清学检测方法众多，每种方法有其自身的特点，在布病的诊断也应用最广，但血清学检测还有一定的假阳性与假阴性，我们应多种检测方法的联合应用以及结合临床和流行病学信息来综合判断。

参考文献

[1]孙岩,肖培,王娜,等.倍比稀释虎红平板凝集试验对布鲁氏菌病诊断的探讨[J].中国媒介生物学及控制杂志,2014,25(4):294-296.

[2]张国庆,孙国芳,敖敏高娃.纤维蛋白原对布鲁杆菌抗体检测的影响[J].现代中西医结合杂志,2013,22(01):84-85.

[3]RoushanMR,AmiriMJ,LalyA,MostafazadehA,BijaniA.Follow-upstandardagglutinationand2-mercaptoethanoltestsin175clinicallycuredcasesofhumanbrucellosis[J].IntJ.InfectDis,2010,14(3),e250-e253

[4]曾庆贺.布鲁氏菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立和临床应用的初步研究[D].吉林大学,2014.

[5]PrinceHE,LopezJC,,etal.PerformancecharacteristicsoftheEuroimmunenzyme-linkedimmunosorbentassaykitsforBrucellaIgGandIgM.[J].DiagnosticMicrobiology&InfectiousDisease,2009,65(2):99-102..

[6]ManturB,ParandeAS,etal.ELISAversusconventionalmethodsofdiagnosingendemicbrucellosis.[J].AmericanJournalofTropicalMedicine&Hygiene,2010,83(83):314-8.

[7]SmitsHL,AbdoelTH,SoleraJ,etal.ImmunochromatographicBrucella-specificimmunoglobulinMandGlateralflowassaysforrapidserodiagnosisofhumanbrucellosis.[J].Clinical&DiagnosticLaboratoryImmunology,2003,10(6):1141-6.

[8]程婷婷,石峰,陈创夫,等.布鲁氏菌抗体胶体金免疫层析法快速检测技术的建立[J].中国病原生物学杂志,2014(2):122-126.