AP注射 Orexin-A对顺铂诱导大鼠厌食作用的影响

AP注射 Orexin-A对顺铂诱导大鼠厌食作用的影响

张雪华 1,2， 张接印 3 ，马晓琳 2

1 青岛大学 基础医学院 山东 青岛 266021 中国； 2曹县人民医院急诊科 山东 菏泽 274000 中国； 3 曹县桃源镇卫生院 山东 菏泽 274000 中国

摘要：

目的：极后区（AP）微量注射Orexin-A对顺铂诱导大鼠厌食或异食癖的影响及潜在机制。方法：观察腹腔注射顺铂对Orexin-A表达的影响；AP微量注射Orexin-A对顺铂诱导的胃牵张反应（GD）神经元放电活动的影响；ELISA观察AP微量注射Orexin-A对腹腔注射顺铂大鼠脑脊液P物质的影响。结果：腹腔注射顺铂AP Orexin-A mRNA表达显著减少；顺铂可兴奋GD-E神经元抑制GD-I神经元，而Orexin-A可显著抑制GD-E神经元增加GD-I神经元放电频率，腹腔注射顺铂大鼠AP注射Orexin-A，对GD-E神经元放电活动的抑制作用减弱，对GD-I神经元放电兴奋作用增强；腹腔注射顺铂可显著升高大鼠脑脊液中P物质含量，Orexin-A可抑制P物质升高；腹腔注射顺铂大鼠摄食量显著减少，AP微量注射Orexin-A可改善顺铂诱导的厌食效应，[D-Lys-3]-GHRP-6可部分减弱Orexin-A抵抗顺铂的厌食效应。结论：AP有与胃牵张感觉传入相关神经元，顺铂可影响这些神经元的兴奋性，Orexin-A也参与顺铂对这些神经元兴奋性的调控；AP Orexin-A可减弱顺铂诱导的厌食或异食癖效应，P物质和Ghrelin受体信号系统可能也参与了该过程调控。

关键词：Orexin-A；AP；顺铂；厌食；异食癖

引 言

顺铂是肿瘤化疗常用药，在多种化疗药物中具有重要地位，其治疗效果好，应用广泛^[1]。顺铂能促进中枢P物质mRNA表达，增加P物质在脑内的含量。顺铂等化疗药物可增加人血浆中P物质含量，这些外周循环的P物质可穿过血脑屏障到达中枢发挥作用。Orexin-A又称胖素，侧脑室或LHA注射Orexin-A，大鼠食物摄入量显著增加^[2]。啮齿类动物中枢注射Orexin-A可显著促进其胃肠运动，增加摄食量和体重。Ghrelin是一种主要由胃窦粘膜细胞分泌的含有28个氨基酸的脑肠肽，是生长激素促分泌受体（GHSR）的内源性配体。AP注射Ghrelin可显著增加大鼠摄食量^[4]。本研究拟采用核团微量注射、单细胞放电记录、real time-PCR等方法，观察AP 内Orexin-A对接收来自胃牵张的传入信息神经元调控；探讨AP Orexin-A对顺铂所致大鼠食欲减退或异食癖的影响，以及与P物质表达、ghrelin受体信号通路的关系，希望通过本研究能为临床提高癌症患者生活质量提供实验依据。

材料与方法

1 实验动物

雄性Wistar大鼠，体质量在250–300 g，给予实验室标准饮食，自由进食和饮水。

2 实验方法

2.1 Real-time PCR方法，观察腹腔注射顺铂对AP中Orexin-A mRNA表达的影响。选取30只大鼠随机分为3组（n=10），①生理盐水对照组（NS组）：腹腔注射生理盐水4 mL/kg；②24 h顺铂注射组：腹腔注射顺铂4 mL/kg；③48 h顺铂注射组：腹腔注射顺铂4 mL/kg。观察和比较顺铂对AP Orexin-A mRNA表达的影响。

2.2 单细胞外放电记录，观察AP微量注射Orexin-A对顺铂诱导的胃牵张反应（GD）神经元放电活动的影响。本实验选取100只大鼠（腹腔注射NS大鼠40只，腹腔注射顺铂大鼠60只），采集GD神经元，通过多管微电极将药物喷洒于神经元上，记录用药前后单细胞外放电活动改变。当用药前后神经元放电频率增加/减少20%，即该神经元兴奋/抑制。

2.3 喂食标准动物饲料食物或高岭土，观察AP 微量注射Orexin-A对顺铂诱导摄食活动的改变，以及Ghrelin受体信号通路在该过程的调控。40只大鼠随机分为4组（n=10）：①NS_ip+NS_AP组：腹腔注射NS（4 mL/kg），AP注射NS 0.5μl；②顺铂_ip+NS_AP组：腹腔注射顺铂（4 mg/kg），AP注射NS 0.5μl；③顺铂_ip+Orexin-A_AP组：腹腔注射顺铂（4 mg/kg），AP注射Orexin-A（150 pmol/0.5μl）；④顺铂_ip+Orexin-A_AP+[D-Lys-3]-GHRP-6_AP组：腹腔注射顺铂（4 mg/kg），AP注射Orexin-A（150 pmol）和[D-Lys-3]-GHRP-6（30 nmol）混合液0.5μl。腹腔注射顺铂仅注射1次，AP注射药物连续5天，每天1次。

2.4 采用ELISA检测方法，观察AP微量注射Orexin-A对顺铂导致的脑脊液P物质改变的影响。40只大鼠随机分为4组（n=10）：①NS

_ip+NS_AP组：腹腔注射NS（4 mL/kg），AP注射NS；②顺铂_ip+NS_AP组：腹腔注射顺铂（4 mg/kg），AP注射NS；③顺铂_ip+Orexin-A_AP组：腹腔注射顺铂（4 mg/kg），AP注射Orexin-A（150 pmol）；④顺铂_ip+Orexin-A_AP+[D-Lys-3]-GHRP-6_AP组：腹腔注射顺铂（4 mg/kg），AP注射Orexin-A（150 pmol）和[D-Lys-3]-GHRP-6（30 nmol）混合液。所有AP注射量均为0.5μl，实验结束后24 h收集大鼠脑脊液，检测脑脊液P物质含量。

3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，实验数据均以mean ± SD表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 腹腔注射顺铂对AP Orexin-A mRNA表达的影响

与NS组相比，腹腔注射顺铂24 h或48 h后，大鼠AP Orexin-A mRNA的表达均显著减少。但腹腔注射顺铂24 h与48 h组相比，AP Orexin-A mRNA表达无显著差异（P>0.05）。

2 AP微量注射Orexin-A对顺铂诱导GD神经元放电活动改变的影响

AP微量注射Orexin-A可显著抑制GD-E神经元的放电活动（P <0.05）；但可使GD-I神经元放电活动增强（P <0.05）。与NS_ip+NS_AP组大鼠相比，顺铂_ip+NS_AP组大鼠GD-E神经元放电频率显著增加（P <0.05），而GD-I神经元放电频率显著降低（P <0.05）；与NS_ip+NS_AP组大鼠相比，腹腔注射（ip）NS，AP微量注射Orexin-A可显著抑制GD-E神经元的放电活动（P< 0.05），但GD-I神经元放电频率显著增加（P <0.05）；与顺铂_ip+NS_AP组相比，顺铂_ip+Orexin-A_AP大鼠GD-E神经元放电频率显著降低（P< 0.05），而GD-I神经元放电频率显著增加（P <0.05）。且Orexin-A诱导的GD神经元兴奋/抑制作用可被AP预先注射Orexin-A受体拮抗剂SB-334867完全阻断（P<0.05）。AP内单独注射SB-334867，GD-反应性神经元放电活动无显著改变（P>0.05）。提示，顺铂可改变GD-反应性神经元的电生理特性，AP Orexin-A可压抑顺铂诱导的神经元兴奋性改变。进一步统计学分析发现，与NS_ip+Orexin-A_AP大鼠相比，顺铂_ip大鼠AP注射Orexin-A，对GD-E神经元放电活动的抑制作用减弱（P<0.05），但对GD-I神经元放电兴奋作用增强（P<0.05）。

3 AP微量注射Orexin-A对顺铂诱导的脑脊液P物质含量改变的影响

与NS_ip+NS_AP组相比，顺铂_ip+NS_AP组大鼠脑脊液中P物质含量显著升高（P<0.05）；与顺铂_ip+NS_AP组相比，若AP微量注射Orexin-A，大鼠脑脊液P物质含量显著降低（P<0.05）；与顺铂_ip+Orexin-A_AP组相比，AP注射Orexin-A+Ghrelin受体阻断剂[D-Lys-3]-GHRP-6混合液，大鼠脑脊液P物质含量显著升高（P<0.05）。

4 AP微量注射Orexin-A对顺铂诱导的大鼠异食癖影响

在顺铂_ip+NS_AP组大鼠，腹腔注射顺铂后1-5d，大鼠高岭土日累计摄入量显著高于NS_ip+NS_AP组（P <0.01）。提示，顺铂可诱导大鼠出现异食癖现象（高岭土摄入量增加）。若预先AP注射Orexin-A（顺铂_ip+Orexin-A_AP组），与顺铂_ip+NS_AP组比较，大鼠1-5 d的高岭土日累计摄入量显著降低（P <0.05），且1-5 天（d）的高岭土累积摄入量降低43 %，即每日注射Orexin-A可改善顺铂诱导的异食癖。若AP注射Orexin-A+[D-Lys-3]-GHRP-6混合液，可部分减弱Orexin-A抵抗顺铂诱导的异食癖（P<0.05）。

讨 论

Orexin-A是下丘脑分泌的神经肽^[3]，可促进啮齿动物的摄食。P物质作为中枢及外周神经激肽，不仅与呕吐相关，还与抑郁、疼痛、哮喘等多种炎症免疫反应相关。本研究发现，腹腔注射顺铂能够促进大鼠脑脊液中P物质含量，这可能是顺铂引起呕吐的主要原因之一；而AP预先微量注射Orexin-A则能够促进大鼠摄食抑制大鼠摄取高岭土，可能与AP预先微量注射Orexin-A后大鼠脑脊液中P物质含量降低有关。研究表明AP部分通过5-HT受体途径参与恶心和呕吐的调控^[4]。本研究结果显示AP外源性Orexin-A可显著增加大鼠摄食，并减轻大鼠异食癖。AP内注射Orexin-A，顺铂治疗组大鼠在6 h内摄食量仅出现中度增加。异食癖通常用于评估顺铂诱导的呕吐和止吐效果

^[5]，AP内注射Orexin-A，顺铂治疗组大鼠的高岭土摄入量减少，异食癖减轻，以上研究结果表明Orexin-A可改善顺铂诱导的胃副作用。单细胞放电研究发现，Orexin-A可显著抑制AP GD-E神经元的放电活动，增强GD-I神经元放电活动；然而，大鼠腹腔注射顺铂后，Orexin-A对腹腔注射顺铂大鼠GD-E神经元放电活动的抑制性减弱，对GD-I神经元放电活动的兴奋性增强。综上所述，AP有与胃牵张感觉传入相关神经元，顺铂可影响这些神经元的兴奋性，Orexin-A也参与顺铂对这些神经元放电活动的调控；AP Orexin-A可减弱顺铂诱导的厌食或异食癖效应，P物质和Ghrelin受体信号系统可能也参与了该过程调控。AP给予orexin-A可能通过ghrelin神经肽系统改善顺铂在化疗过程中诱导的胃功能紊乱，这为临床治疗顺铂诱导的副作用提供了实验依据和新的研究策略。

参考文献

Li M, Zu N, Zhang CS,et al. Orexin A promotes granulosa cell secretion of progesterone in sheep[J]. Iran J Vet Res, 2019, 20(2): 136-142.

Tsuchimine S, Hattori K, Ota M, et al. Reduced plasma orexin-A levels in patients with bipolar disorder[J]. Neuropsychiatr Dis Treat, 2019, 15(8): 2221-2230.

Lorusso V. Management of chemotherapy-induced nausea and vomiting by risk profile: role of netupitant/palonosetron [J]. Ther Clin Risk Manag, 2016, 12(2): 917–925.

Pagnoux C, Hajj-Ali RA. Pharmacological approaches to CNS vasculitis: where are we at now?[J]. Expert review of clinical pharmacology, 2016, 9 (1): 109-116.

Nepovimova E, Janockova J, Misik J, et al. Orexin supplementation in narcolepsy treatment: A review[J]. Med Res Rev, 2019, 39(3): 961-975.