盐酸替罗非班原料药细菌内毒素检查法的建立-中国期刊网

盐酸替罗非班原料药细菌内毒素检查法的建立

刘晓云 1，朱子微 1，潘迎锋 1

1．正大青春宝药业有限公司，浙江杭州 310023

摘要目的：建立盐酸替罗非班原料细菌内毒素的检查方法。方法：依据2015年版《中国药典》“细菌内毒素检查法”项下凝胶法的要求，通过干扰试验确定样品最大无干扰浓度，并进行方法学验证。结果：样品浓度在0.05mg/ml或以下时对鲎试剂与细菌内毒素的凝集反应无干扰作用。结论：所建立的方法可用于盐酸替罗非班原料的细菌内毒素检查。

关键词 盐酸替罗非班；细菌内毒素检查，凝胶法；干扰试验

Establishment of Bacterial Endotoxin Test Method for Tirofiban Hydrochloride

LIU xiaoyun（ChiataiQingchunbao Pharmaceutical Co..Ltd.，Zhejiang Hangzhou 310023,China）

ABSTRACT OBJECTIVE：To establish the Bacterial Endotoxin Test Method for Tirofiban Hydrochloride .METHODS：According to the appendix of the gel method under“bacterial endotoxin test method”in Chinese Pharmacopiea（2015 edition），the maximal non-interference concentrations of samples were determined by interference test ,and then methodology validation was conducted.RESULTS:The agglutination of LAL with bacterial endotoxin had no interference when the sample was diluted to 0.05mg/ml or below. CONCLUSIONS: The established method can be used to detect the bacterial endotoxin of Tirofiban Hydrochloride.

KEYWORDS Tirofiban Hydrochloride; Bacterial endotoxin test; Gel method; interference test

抗血小板治疗在冠状动脉粥样硬化性心脏病治疗中起着十分重要的作用。盐酸替罗非班是一种非肽类的血小板糖蛋白Ⅱ_a/Ⅲ_b受体（该受体是与血小板聚集过程有关的主要血小板表面受体）的可逆性拮抗药，可阻止纤维蛋白原与糖蛋白Ⅱ_a/Ⅲ_b受体结合，从而阻断血小板的交联及血小板的聚集。盐酸替罗非班可抑制二磷酸腺甘诱导的血小板聚集及延长出血时间，可强效抑制血小板功能，作用显著，特异性强^[1]。为提高盐酸替罗非班原料药的质量控制水平，笔者依据2015年版《中国药典》（四部）通则1143“细菌内毒素检查法”项下的凝胶法的要求^[2]，并参考相关文献对盐酸替罗非班原料药的细菌内毒素检查方法进行了研究。

仪器与试药

仪器振荡器，ZH-2 BLENDER；电热恒温鼓风干燥箱，DHG-9146A型，上海精宏实验设备有限公司；细菌内毒素测定仪，BET-72，天津天大天发科技有限公司；

药品与试剂 盐酸替罗非班原料批号：1101-S170301，1101-L170301，1107-L170401，1107-L170402，1107-L170501，浙江浙邦制药有限公司。细菌内毒素工作标准品：10EU\支，批号：1609090，湛江安度斯生物有限公司。细菌内毒素检查用水：5ml/支，批号：1701190，湛江安度斯生物有限公司。鲎试剂：1、灵敏度0.25EU/ml，规格0.5ml/支，批号：1609281，湛江安度斯生物有限公司；2、灵敏度0.125EU/ml，规格0.5ml/支，批号：1602031，湛江安度斯生物有限公司；3、灵敏度0.25EU/ml，规格0.5ml/支，批号：16070312，福州新北生化工业有限公司；4、灵敏度0.125EU/ml，规格0.5ml/支，批号：16070912，福州新北生化工业有限公司。

方法与结果

2.1内毒素限值的确定（L）根据盐酸替罗非班注射液规定的限值1EU/ml，规格5mg/100ml，计算原料的L=1EU/ml*100ml/5mg=20EU/mg，根据从严原则，我们规定盐酸替罗非班原料的细菌内毒素限值为10EU/mg。

2.2鲎试剂灵敏度复核实验^[3-6] 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），用BET水把CSE稀释成2λ，λ，0.5λ，0.25λ的系列浓度，按2015年版《中国药典》（四部）通则1143方法操作，以BET水做2支阴性对照管（NC），对2个厂家生产的TAL进行复核。

若最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。λc=lg^-1(∑X/4)，式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。结果见表1。

表1 灵敏度复核试验结果

鲎试剂	细菌内毒素浓度（EU/ml）					阴性对照	结果
	2.0λ	1.0λ	0.5λ	0.25λ
1609281 安度斯	0.5	0.25	0.125	0.0625	――		ES=0.25
	＋＋＋＋	＋＋＋＋	――――	――――
1602031 安度斯	0.25	0.125	0.0625	0.03	――		ES=0.105
	＋＋＋＋	＋＋＋＋	―＋――	――――
16070312 新北	0.5	0.25	0.125	0.0625	――		ES=0.125
	＋＋＋＋	＋＋＋＋	＋＋＋＋	――――
16070912 新北	0.25	0.125	0.0625	0.03	――		ES=0.0625
	＋＋＋＋	＋＋＋＋	＋＋＋＋	――――

4批鲎试剂灵敏度均在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ），均符合规定，可以用于实验。

2.3干扰初筛试验 根据最大有效稀释倍数MVD=CL/λ,该供试品为原料，MVD取1，对应于灵敏度（λ）0.5、0.25、0.125、0.06、0.03EU\ml的TAL，盐酸替罗非班的最低稀释浓度分别为0.05、0.025、0.0125、0.006、0.003mg/ml。因此用BET水将一批供试品（批号：1101-S170301）分别稀释成0.05、0.025、0.0125、0.006、0.003mg/ml5个浓度，供干扰试验初筛使用。

取灵敏度为0.25EU/ml的TAL（安度斯）24管，其中10支做供试品阴性对照（NPC）系列反应，分别加0.1ml 0.05、0.025、0.0125、0.006、0.003mg/ml各浓度的供试品溶液，每一浓度供试品2支反应管；另10支做供试品阳性对照（PPC）系列反应，即加入含2λ（0.5EU/ml）的内毒素标准溶液的浓度为0.05、0.025、0.0125、0.006、0.003mg/ml的供试品溶液0.1ml，每一浓度供试品2支反应管，选出对2λ细菌内毒素无干扰的供试品浓度。最后取2支加入0.1mlBET水作为阴性对照，2支加入含2λ（0.5EU/ml）的内毒素标准溶液0.1ml作为阳性对照。

表2 干扰初筛试验结果

类别	供试品浓度（mg/ml）
类别	0.05	0.025	0.0125	0.006	0.003
PPC管	＋＋	＋＋	＋＋	＋＋	＋＋
NPC管	――	――	――	――	――
NC管	――
PC管	＋＋

由表2可知，供试品溶液浓度在0.05mg/ml时，对鲎试剂无干扰抑制作用。

2.4干扰试验 将供试品溶液配成干扰初筛试验结果最大不干扰浓度。取灵敏度分别为0.25EU/ml和0.125EU/ml两个生产厂家（分别为安度斯和新北）的TAL，各PC管分别加入0.1ml2λ，λ，0.5λ，0.25λ的细菌内毒素溶液和PPC管分别加入含2λ，λ，0.5λ，0.25λ细菌内毒素的供试品溶液，NC管加入0.1mlBET水，NPC管加入0.1ml供试品溶液。

结果判定：

只有当溶液NC管和NPC管的所有平行管都为阴性，并且系列溶液PC的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液PC和PPC的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。Es=lg^-1(∑Xs/4)，Et=lg^-1(∑Xt/4)式中Xs、Xt分别为系列溶液PC和溶液PPC的反应终点浓度的对数值（lg）。当Es在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及Et在0.5Es～2Es（包括0.5Es和2Es）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。

表3 干扰试验结果

鲎试剂	供试品浓度	供试品批号	细菌内毒素浓度（EU/ml）				结果
鲎试剂	供试品浓度	供试品批号	2.0λ	1.0λ	0.5λ	0.25λ	结果
1609281 安度斯 0.25 EU/ml	BET		＋＋＋＋	＋＋＋＋	――――	――――	Es=0.25
	0.05 mg/ml	1101-S170301	＋＋＋＋	＋＋＋＋	――――	――――	Et=0.25
		1101-L170301	＋＋＋＋	＋＋＋＋	＋＋＋＋	――――	Et=0.125
		1107-L170401	＋＋＋＋	――――	――――	――――	Et=0.5
1602031 安度斯 0.125 EU/ml	BET		＋＋＋＋	＋＋＋＋	―＋――	――――	Es=0.105
	0.05 mg/ml	1101-S170301	＋＋＋＋	――＋―	――――	――――	Et=0.21
		1101-L170301	＋＋＋＋	＋＋＋＋	―――＋	――――	Et=0.105
		1107-L170401	＋＋＋＋	＋＋―＋	――――	――――	Et=0.149
16070312 新北 0.25 EU/ml	BET		＋＋＋＋	＋＋＋＋	＋＋＋＋	――――	Es=0.125
	0.05 mg/ml	1101-S170301	＋＋＋＋	＋＋＋＋	＋＋―＋	――――	Et=0.149
		1101-L170301	＋＋＋＋	＋＋＋＋	――――	――――	Et=0.25
		1107-L170401	＋＋＋＋	＋＋＋＋	＋＋＋＋	――――	Et=0.125
16070912 新北 0.125 EU/ml	BET		＋＋＋＋	＋＋＋＋	＋＋＋＋	――――	Es=0.0625
	0.05 mg/ml	1101-S170301	＋＋＋＋	＋＋＋＋	――――	――――	Et=0.125
		1101-L170301	＋＋＋＋	＋＋＋＋	―＋――	――――	Et=0.105
		1107-L170401	＋＋＋＋	＋＋＋＋	――――	――――	Et=0.125

由表3可以看出，Es在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及Et在0.5Es～2Es（包括0.5Es和2Es），供试品在该浓度下对鲎试剂无干扰作用。

2.5样品细菌内毒素检查

取5批盐酸替罗非班原料，用BET水稀释0.05mg/ml，使用λ=0.25EU/ml（安度斯）的TAL进行细菌内毒素检查，其中PC管分别加入0.1ml2λ的细菌内毒素溶液和PPC管加入含2λ细菌内毒素的供试品溶液，NC管加入0.1mlBET水，NPC管加入0.1ml供试品溶液。

表4 5批样品细菌内毒素检查

样品批号	NPC	PPC	PC	NC
1101-S170301	――	＋＋	＋＋	――
1101-L170301	――	＋＋	＋＋	――
1107-L170401	――	＋＋	＋＋	――
1107-L170402	――	＋＋	＋＋	――
1107-L170501	――	＋＋	＋＋	――

5批盐酸替罗非班原料细菌内毒素符合规定。

讨论

细菌内毒素检查法具有灵敏度高，操作简便，快速，重现性强等优点。盐酸替罗非班注射液已有细菌内毒素检查的质量标准^[7]，为更好的控制其质量，本文对盐酸替罗非班原料药的细菌内毒素检查的进行研究。经以上试验结果论证，将盐酸替罗非班原料配制成0.05mg/ml浓度时，三批原料对2个厂家的2个规格的鲎试剂检查均无干扰。因此，可用凝胶法对盐酸替罗非班原料进行细菌内毒素检查。

参考文献

［1］吴燕，周敏，张福成.HPLC法测定盐酸替罗非班原料药的含量及有关物质[J].中国药房,2015,26（3）:404-406.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].2015年版.北京:中国医药科技出版社.附录1143细菌内毒素检查法：154-156.

［3］王婷婷,周瑞.骨肽注射液细菌内毒素检查方法的建立[J].中国药房,2016,27（36）:5151-5152.

［4］周彬, 臧晓红,顾佳.丙泊酚原料药细菌内毒素检查方法的验证[J].食品与药品,2016,18（5）:339-343.

［5］孟军.凝胶法检查穿琥宁注射液细菌内毒素[J]科技创新导报,2015（5）:30-32

［6］田祥学.细菌内毒素检查法及其在药品检验中的应用[J] .中国医药指南，2015,13（23）：278-279.

［7］进口药品注册标准[S].JX20080265 盐酸替罗非班注射液.

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