一类仑伐替尼衍生药物的制备和应用

一类 仑伐替尼衍生药物的制备和应用

王俊凯 徐燕 唐海金 李雪 戚鑫 韩光

成都蓝蜻蜓生物技术有限公司 成都市 610000

摘要

仑伐替尼是一个具有多靶点的小分子酪氨酸酶抑制剂，尤其对VEGFR有更强的抑制活性，其市场反应较好，但存在一定的缺陷。本文对仑伐替尼进行一定的机构优化，开发了两种仑伐替尼的衍生药物并对其进行体外活性研究，同时详细描述了该类衍生药物的合成方法和作用，以期使得该类药物更加安全、有效。

关键词 仑伐替尼 衍生 体外活性

正文

肝癌是全球第三大癌症死亡的主要原因，其主要是由乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒的慢性感染、酗酒及代谢综合征（糖尿病和肥胖症）引起的^[1-2]。中国是肝癌大国。据统计，全世界每年因肝癌造成70多万人死亡；仅在我国，每年的新发病例数及死亡病例数占全世界总例数的50%以上^[3-4]。

根据恶性肿瘤细胞起源，原发性肝癌主要分为肝细胞癌(HCC)、肝内胆管细胞癌(ICC)和HCC-ICC混合型3种。其中，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占所有原发性肝癌的85%-90%，是我国最常见的恶性肿瘤之一^[3-4]。它是一种具有高度血管依耐性的实体肿瘤。HCC发生过程中，血管内皮生长因子受体（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor,VEGFR）和血小板衍生生长因子受体（Platelet-derived Growth Factor Receptor,PDGFR）异常，可使RAS/MAPK通路下游上调，导致血管生成增加和细胞增殖，与HCC和转移相关。

乐伐替尼（Lenvatinib，E7080），一个具有多靶点的小分子酪氨酸酶受体抑制剂，主要靶点有VEGFR1-3，FGFR1-4，RET，c-KIT等。乐伐替尼于2015年2月获FDA批准用于晚期放射性-碘难治性分化型甲状腺癌的治疗。2018年，FDA证实批准乐伐替尼用于初治晚期不可手术的肝细胞肝癌的治疗^[5-6]。相隔不到一个月，中国CFDA正式确认乐伐替尼在国内获批上市，用于晚期肝癌的一线治疗。虽然研究证实乐伐替尼药效要好于索拉菲尼,但乐伐替尼仍存在缺陷^[7]。

乐伐替尼开发之初，其目的是用于甲状腺癌的治疗，并不是针对HCC开发。体外研究表明，其作用于VEGFR效果较好，但作用于PDGFR效果较弱。作用于VEGFR2-3比作用于FGFR1、PDGFR选择性高10倍。另外，由于乐伐替尼游离态（结构式如式①）在各种常用溶剂中均很难溶，合成其甲磺酸盐时，选用醋酸为溶剂，然后加入甲磺酸成盐（参考日本卫材专利WO2016/031841），该工艺不可避免的会导致基因毒性杂质的出现（例如式②等）。合成乐伐替尼时，只能尽可能的减少基因毒性杂质，而难以彻底除去基因毒性杂质。

式① 式②

口服乐伐替尼不良反应较多，如高血压、腹泻、食欲降低、体重减轻和疲劳等。如此多的副反应，也可能与乐伐替尼各种基因毒性杂质太多有关^[7]。

针对以上缺陷，本发明对乐伐替尼的结构进行了改良，以期望其针对肝细胞癌能发挥出更好的药效，同时减少药物中基因毒性杂质，降低药物副作用。因此，我们提出一种酪氨酸激酶抑制剂及其应用，以便于解决上述中提到的问题。

对此我们设计出仑伐替尼的衍生药物，为化合物A和化合物B。

化合物A 化合物B

一、制备衍生药物

首先对化合物A和化合物B进行制备，两者的制备方法一致。以化合物A为例：

化合物A的制备方法，如图1中所示；

图 1

1. 化合物3的合成

将900ml DMSO加入3L反应瓶，再加入64g KOH，抽真空，氮气置换一次，并保持通氮气下，向反应瓶中加入98.9g 化合物1。

用100ml DMSO冲洗粘壁物料。将反应液冷却20-25℃，向反应瓶中滴加水（滴加时间10-15分钟），（反应略有放热）控制温度小于40℃。

水滴加完后，保持搅拌，待体系由红棕色变成暗黑色(约0.5-1h)，体系变色后再继续搅拌10-15分钟。

一次性将100g 化合物2加入到反应瓶中，升温至90℃，搅拌反应2小时，降温至55℃，依次向反应液中滴加500ml丙酮和1000ml水，滴毕后保温50至55℃搅拌30分钟。降温至30-35℃，再冰水浴降至5-10℃，保温搅拌30分钟。

抽滤，滤饼用100ml丙酮/200ml水的混合溶液洗涤，再用水洗涤滤饼至滤液基本无色；90℃以下，真空/鼓风干燥至水分小于0.2%，得类白色至红黄色固体（化合物3）132.0-138.0g，收率：91-95%；

液相检测，若单一杂质≥0.2%，则进行纯化，纯化步骤如下：将粗品132g加入到10ml/g THF中，加热回流2-3h，降温至10-20℃，过滤，滤饼用少量THF淋洗。60-80℃真空烘干，得成品118.8g，收率：85-90%。

2. 化合物4的合成

称取130g化合物3加入到氮气保护下的3L三口瓶，加1300ml DMF，加65.8g吡啶，5.4g水，搅拌，降温至0-5℃，滴加142.0g氯甲酸苄酯到反应瓶中，滴毕，0-10℃反应。

滴加完后约30分钟，体系会析出固体，体系呈粘稠状。

反应约3小时后，向反应液中滴加1300ml水，控温小于等于20℃滴加，（刚加水时会放热）滴毕，搅拌0.5小时，控温10-20℃，抽滤，滤饼用520ml水洗涤。

再用520ml丙酮洗涤，60℃-70℃真空干燥至水分小于0.5% ，得白色或类白色固体（化合物4）162g，收率约90%。

3. 化合物A的合成

称取125.7g 盐酸金刚烷胺，92.6g 碳酸钾加入到氮气保护下的3L三口瓶，加800ml DMF，加热至50℃搅拌1小时，加入53g吡啶，然后加入160g 化合物4，50℃搅拌反应约2小时后。向反应液中滴加1600ml水，控温小于等于20℃滴加，（刚加水时会放热）滴毕，搅拌0.5小时，控温10-20℃，抽滤，滤饼用1120ml水洗涤，再用560ml乙醇洗涤。60℃-70℃真空干燥至水分小于0.5% ，得白色或类白色固体（化合物二）157g。收率约90%。

4. 精制

将所得粗品加入800ml乙醇回流1小时，冷却过滤即得纯品。

MS：m/z(ES):521.2,522.2[M+1]。

1H-NMR：

(400MHz ,d6-DMSO):8 .67(d ,2H) ,8 .28(d,1H) ,8.01(s ,1H) ,7 .86(s ,1H) ,7.75(s ,1H) ,7.51(s ,1H) ,7.47(d ,1H) ,7.18~7.21(dd ,1H) ,6.87(s ,1H) ,6.52(d ,1H) ,4.03(s ,3H),2.03(s ,3H),1.96(s ,6H),1 .64(s ,6H)。

5. 化合物B的合成

制备流程参考化合物A的合成；将盐酸金刚烷胺替换成盐酸美金刚，可制得化合物B。

MS：m/z(ES):549.2,550.2[M+1]。

1H-NMR：

(400MHz ,d6-DMSO):8 .67(d ,2H) ,8 .27(d,1H) ,8.00(s ,1H) ,7 .86(s ,1H) ,7.75(s ,1H) ,7.51(s ,1H) ,7.47(d ,1H) ,7.18~7.21(dd ,1H) ,6.90(s ,1H) ,6.51(d ,1H) ,4.03(s ,3H),2.10(s ,1H),1.78(s ,2H),1.60(s ,4H),1.35(d ,2H),1.28(d ,2H),1.12(s ,2H),0.83(s ,6H)。

6. 化合物A盐酸盐的制备

称取10g化合物A，加入300ml乙醇溶清，滴加10ml 15%的氯化氢乙醇溶液，滴毕，室温搅拌2小时，过滤，乙醇洗涤滤饼，真空干燥得约9g白色固体。

7. 化合物B盐酸盐的制备

制备流程参考化合物A盐酸盐，可制得化合物B的盐酸盐。

二、纯度实验

1、实验条件

检测器：紫外吸收计（测量波长：252nm）；

柱子：WONDASIL C18 SUPERB 5um 4.6MM*250MM；

柱温：恒温接近40℃；

流动相：如表1所示，用线性梯度洗提具有以下组成的溶液A和溶液B；

溶液A：水/乙腈/70.0~72.0% 分析纯高氯酸 （990:10:1，V/V/V）；

溶液B：水/乙腈/70.0~72.0% 分析纯高氯酸 （100:900:1，V/V/V）；

流速：1.0ml/min

【表1】

2. 实验原理

采用外标法检测文中实施例3或4制备的化合物A或B的盐酸盐和采用专利WO2016/031841方法制备的式①甲磺酸盐中式②的含量。

3、实验结果

【表2】

由表2可知，化合物A和化合物B盐酸盐，未检测出上文所述基因毒性杂质式②。而乐伐替尼甲磺酸盐现有工艺不可避免的会出现基因毒性杂质式②。

三、体外酶活性抑制测试

1、测试原理

通过Envision检测Assay plate中的化学发光，以化合物的IC50值为指标，来评价化合物对酪氨酸激酶的抑制作用。

2、测试方法

本体外酶活性抑制测试筛选了VEGFR2酶，VEGFR3酶，PDGFRα酶以及DNA-PK酶，四种酶对化合物A,B进行测试。

以PDGFRα酶为例，在激酶缓冲液中稀释酶、底物、ATP和抑制剂。添加1μl抑制剂（5％DMSO）、2μl酶（2ng）、2μl底物/ATP混合物（25uM ATP，0.2μg/μlPolyE4Y1）到384孔低容量微孔板中，在25℃孵育120分钟。加入5μlADP-Glo™试剂，在25℃孵育40分钟。加入10μl激酶检测试剂，在25℃孵育30分钟。记录发光值（积分时间0.5秒）。激酶缓冲液：40mM Tris，pH 7.5；20mM氯化镁；0.1mg/ml牛血清白蛋白（BSA）；50μMDTT。

化合物检测8个浓度梯度，最高浓度为10µM，依次往下做5倍稀释。化合物浓度排布图（layout）如下【表3】。

【表3】

LQTX001-A对应上文所述化合物A，LQTX001-B对应上文所述化合物B，LQTX001-DZ对应已上市乐伐替尼。STSP/Wortmannin为阳性药。VEGFR2酶，VEGFR3酶，PDGFRα酶三种酶对应STSP阳性药，DNA-PK酶对应Wortmannin阳性药。

3. 测试数据：

测试四种酶的原始数据及%酶活率分别如下【表4,5,6,7】。

【表4：VEGFR2酶的作用数据及%酶活率】

【表5：VEGFR3酶的作用数据及%酶活率】

【表6：PDGFRα酶的作用数据及%酶活率】

【表7：DNA-PK酶的作用数据及%酶活率】

统计上述所有数据，更直观的酶活性和浓度梯度的线性图如下【图1,2,3,4】。

【图1：VEGFR2酶】

【图2：VEGFR3酶】 【图3：PDGFRα酶】

【图4：DNA-PK酶】

3. 试验结论

【表8：化合物A,B对体外酶活性的不同抑制作用】

由表8可知，化合物A和B对试验中的酪氨酸激酶均具有抑制作用，尤其是对PDGFR具有更好的抑制作用，且对PDGFRα激酶的抑制作用优于对照式①（乐伐替尼），尤其是化合物A。

综上所述，我们发现该类仑伐替尼衍生药物具有潜在的研究价值，尤其是化合物A，同时由于研究时限的问题我们还未对其他靶点进行研究，如RET，c-KIT，MET，TAK-TAB等都可进行研究，该类衍生药物改变了靶点的特异性研究方向，从VEGFR转向了PDGFR。从结构上，我们可以尝试在金刚烷胺醇替代金刚烷胺，增加其亲水性。从体外活性测试上，我们也会进一步研究其他靶点的抑制活性以及其细胞毒性，以论证该类衍生物具有更好的潜在价值。

参考文献

[1] HUNYADY B, GERLEI Z, GERVAIN J, et al, Screening, diagnosis, treatment, and follow up of hepatitis C virus related liver disease. National consensus guideline in Hungary from 22 September 2017[J]. Orvosi Hetilap, 2018, 159(suppll 1):3-23.

[2] WANG L, LIU Y, ZHOU W, et al. Treatment related sever and fatal adverse events with molecular targeted agents in the treatment of advanced gastric cancer: a ment-

Analysis[J]. Onco Targets and therapy, 2017, 10:2281-2287.

[3]CHEN W, ZHENG R, BAADE PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(2): 115-132. DOI: 10.3322/caac.21338.

[4]GORDAN JD, KENNEDY EB, ABOU-ALFA GK, et al. Systemic therapy for advanced hepatocellular carcinoma: ASCO guideline[J]. J Clin Oncol, 2020, 38(36): 4317-4345. DOI: 10.1200/JCO.20.02672.

[5]Nakazawa Y, Kawano S, Matsui J, et al. Multitargeting strategy using Lenvatinib and golvatinib: Maximizing anti-angiogenesis activity in a preclinical cancer model[J]. Cancer science, 2015, 106(2):201-207.

[6] Wiegering A, Korb D, Thalheimer A, et al. E7080(Lenvatinib), a multi-targeted tyrosine inhibitor, demonstrates antitumor activites against colorectal cancer xenografts[J]. Neoplasia(New York, NY), 2014, 16(11):972-981.

[7] 玉井俊行.肝细胞癌的治疗:日本,CN 110831597 A[P].2020-02-21:71-73.

8