活血疏肝理气法对骨髓干细胞移植肝郁血瘀证急性心肌梗死大鼠心肌纤维化及心肌酶CK,CK-MB水平的影响研究

活血疏肝理气法对骨髓干细胞移植肝郁血瘀证急性心肌梗死大鼠心肌纤维化及心肌酶 CK,CK-MB水平的影响研究

向忠军 1 薛丽君 2 杨婷 3 胡晶 4

长沙医学院，湖南 长沙 410219

摘 要：目的 探讨活血疏肝理气法对骨髓干细胞移植肝郁血瘀证急性心肌梗死大鼠心肌纤维化、心肌酶CK,CK-MB水平的影响，以及对心肌缺血的保护作用。方法 采用激怒大鼠结合西药干预的方法建鼠肝郁血瘀证动物模型，在此基础上再采用结扎鼠左冠状动脉前降支的方法建鼠急性心肌梗死(AMI)模型,在心电图评价的基础上将造模成功的动物随机分为:A活血疏肝理气组(给予疏肝理气活血药治疗)、B组（MSCs植入）、C活血疏肝理气组(给予疏肝理气活血药治疗)+（MSCs植入）及D模型组、E假手术组,以E组为对照,共5组，每组6只,模型组和假手术组给予生理盐水进行干预。选择治疗后第30天,观察各组大鼠心肌纤维化变化及心肌酶CK,CK-MB水平。结果 心肌纤维化及心肌酶CK,CK-MB水平，模型组大鼠心肌纤维化及心肌酶CK,CK-MB水平较假手术组及各实验组明显有变化(P＜0.01)；且活血疏肝理气组优于MSCs组（P＜0.05），活血疏肝理气组＋MSCs组优于MSCs组、活血疏肝理气组（P＜0.05）。结论 活血疏肝理气法结合骨髓干细胞移植，能降低心肌酶CK及心肌酶CK-MB活性，改善心肌缺血大鼠血液流变学指标，对缺血心肌具有保护作用，其可能作用机制为扩张冠状动脉，改善心肌内血液循环，增加冠脉血量，增加心肌供氧，促进血管再生。

关键词：活血疏肝理气法；心肌纤维化；心肌酶CK；心肌酶CK-MB；大鼠

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）致病率逐年增高，且呈显出年轻化，其早已成为人类主要疾病之一^[1]。骨髓间干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）有其自身的特殊性及优势，为治疗AMI已经较为成熟^[2]。相关研究显示，MSCs可促进心肌细胞再生、梗死区血管新生、梗死区域细胞的凋亡，改变心肌功能具有明显作用^[3]。中医药相关研究表明，中药联合BMSCs可调控BMSCs的活力，减缓BMSCs凋亡，为BMSCs移植疗法提供良较好基础^[4]。活血疏肝理气法由柴胡、枳壳、白芍、川芎、蒲黄、五灵脂等配伍组成，全方具有活血化瘀、疏肝理气作用，为中医治疗冠心病气滞血瘀型常用治法。为研究该活血疏肝理气法对AMI后大鼠的扩张冠状动脉，改善血液循环，增加冠脉血流量，增加供氧，促进血管再生作用提供借鉴，本实验通过人为干预方法构建AMI大鼠模型，观察中医药活血疏肝理气法对大鼠心肌纤维化及心肌酶CK,CK-MB水平的影响，探讨其作用机制。

1 实验器材

1.1 动物 10周左右龄清洁级SD大鼠30只，雌雄各半，体质量（190±30）g，用于实验。长沙医学院实验动物中心提供。大鼠采用普通饲料饲养，自由饮食，12 h/ 12 h明暗环境交替。

1.2实验药物及试剂 活血疏肝理气法，药物组成：柴胡、枳壳、白芍、川芎、炙甘草、 香附、陈皮、蒲黄、五灵脂。以上药物均同一批次购长沙医学院第一附属医院中药房，由该院煎药室煎煮，浓缩至含原药材0.35 g/mL，共200 mL，5 ℃冰箱保存备用。硝酸异山梨酯片(消心痛，北京双桥制药公司，国药准字H17021331)，

20％乌拉坦溶液(由河北医科大学实验室提供)，心肌酶三联试剂盒(北京中生生物工程高技术公司)。

1.3 主要试剂与仪器 BEcKMANcX7型全自动生化分析仪(美国贝克曼公司)，FXSC0—2050A全自动血液流变快测仪(重庆维多科技有限责任公司)，ECG6951D型心电图机(上海光电医用电子仪器有限公司)。

2 实验方法

2.1 骨髓间充质干细胞制备和培养 从5周雄性SD小鼠股骨中采集细胞，采用全骨髓贴壁法结合密度梯度离心法进行分离、培养。经多次换液和消化，将传至P3的BMSCs采用流式细胞仪检查细胞表面抗原，以CD34阳性率低于5%及CD90、CD44阳性率高于95%鉴定所得细胞为高纯度的BMSCs。

2.2 造模分组及给药 参照文献方法，证实大鼠AMI造模成功[5-6]。SD大鼠随机分为A组(给予疏肝理气活血药治疗)、B组（MSCs植入）、C (给予疏肝理气活血药治疗)+（MSCs植入）及D模型组、E假手术组,以E组为对照,每组6只。假手术组只穿线不结扎，其余各组进行AMI造模。BMSCs组和中药＋BMSCs组冠状动脉结扎半小时后，于梗死区边缘心肌组织3个位点直接注入共100 μL BMSCs细胞悬液，假手术组和模型组则注入100 μL PBS。术后各组分笼饲养，给予常规饲料和饮水，48 h后，每日9:00中药组和中药＋BMSCs组给予1 mL/100 g活血疏肝理气中药药液灌胃，其余各组用给予等量生理盐水灌胃，连续30天。

2.3标本采集与检测

1)灌胃30天后心肌纤维化。开大鼠胸腔,取心脏，用生理盐水清洗后，10%甲醛固定液固定50h后,二甲苯脱脂,脱水,石蜡包埋，切片,HE染色。最后心肌沿短轴横切成2 mm厚薄片，置人含0.5%NBTpH7.4的磷酸盐缓冲液,37.2°C恒温水浴染色20 min,观察心肌纤维化。

2)末次给药后4h。取大鼠腹主动脉血，然后断头处死各组大鼠，取动脉血，按试剂盒说明测定心肌酶CK及CK-MB。

3 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件进行分析。实验数据以 ±s表示，进行方差齐性检验，方差齐采用方差分析，方差不齐采用非参数检验或Welch检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 心肌纤维化的影响

心肌未见明显的病理形态改变，横纹较清晰（假手术组）；心肌病理形态改变较明显，心肌间质炎性细胞浸润、细胞肿胀明显，部分细胞变性、坏死，肌束排列不整齐（模型组）；细胞肿胀及肌束紊乱程度较模型组减轻（MSCs植入）；有少许炎性细胞浸润，细胞肿胀轻度，肌束紊乱程度有所改善（疏肝理气活血药）；肌束排列较整齐，细胞肿胀轻度，炎性细胞浸润改善，细胞溶解情况减少（疏肝理气活血药+MSCs植入）。

4.2 心肌酶CK、CK-MB水平的影响

与假手术组比较，模型组大鼠血浆中CK、CK-MB水平均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，各实验组大鼠血浆中CK、CK-MB水平均显著降低（P＜0.05），其中，活血疏肝理气组优于MSCs组（P＜0.01），活血疏肝理气＋MSCs组优于活血疏肝理气组，差异有统计学意义（P＜0.01）。提示各组可保护心肌细胞膜的完整性，减少CK、CK-MB的外漏，增强心肌细胞对抗AMI的能力，各组大鼠血浆中CK、CK-MB水平的测定结果见表1。

表1：各组大鼠血浆中CK、CK-MB水平的测定结果（x±s，n＝6）

组别	只数		CK，ng/mL	CK-MB，ng/mL
假手术组		6	82.079±15.076	48.671±1.819
模型组		6	159.715±25.719＊＊	108.671±1.819＊＊
MSCs组		6	101.801±11.825 #	82.978±1.854 #
活血疏肝理气中药组		6	91.396±7.581 #△	72.038±2.551#△
活血疏肝理气中药＋MSCs组		6	75.310±6.30 #△▲	61.023±1.233 #△▲

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与MSCs组比较，△P＜0.05；与活血疏肝理气组比较，▲P＜0.05。

5 讨论

心肌梗死在当今被认为是人类最主要杀手之一。相关方法可以提高存活率，但已梗死的细胞却不能再生；移植术是末期心脏病最有效的治疗方法，却受到供体来源、免疫排斥等因素的限制。近年干细胞定向分化心肌细胞或移植治疗心血管疾病受到广泛关注^[7]，相关研究表明中医药会明显提高干细胞向心肌细胞分化的效果，中药与干细胞移植合用，可起到优势互补、协同增效的作用^[8]。

近年来BMSCs移植治疗，因具有可行性高等优势，已经成为治疗AMI新途径研究的热点，但其也有缺点，如移植细胞的数量和活性问题^[9]，中医药对AMI保护作用具有多靶点、多层面的特点，相关实验研究表明多种中药对干细胞的有调控作用，结合中医药治疗心肌梗死具有明显优势^[10－12]。

中医学的真心痛与现代医学的心肌梗死的临床表现非常相似，中医理论认为“真心痛”血瘀证的主要病机为“心阳衰微，阴寒之邪困阻，心脉痹阻”，病位，以“心”为主。活血疏肝理气法方是针对气滞血瘀证而成，方有柴胡、枳壳、白芍、川芎、炙甘草、香附、陈皮、蒲黄、五灵脂九味药物组成，失笑散（蒲、脂）活血化瘀，祛瘀止痛，二者同为君药；柴胡、香附、枳壳、陈皮，疏肝健脾理气，调理气机，气行则瘀散，为臣药；白芍、川芎，补血活血，柔肝健脾，缓急止痛，通利血脉之功，为佐药；炙甘草调和诸药，缓急止痛，兼为佐使药。诸药合用可谓主次有别，恰合病机。本项旨在中医的活血祛瘀疏肝理气法指导下，对气滞血瘀证亚型的研究，从而创拟一个组方严谨、安全可靠、作用及机制明确的有效配伍复方。

综上所述，活血疏肝理气法结合骨髓干细胞移植方法，可改善大鼠急性心肌梗死局部病理改变及减少纤维化，降低心肌酶活性，减少梗死面积，扩张冠状动脉，改善血液循环，增加冠脉流量及心肌供氧，促进血管再生，具有保护心肌性损伤作用。

参考文献

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湖南省教育厅科学研究一般项目（19C0186）

[作者简介] 向忠军 男 讲师 教学方向：中药及中医方剂学