CD4+ CD25+调节性T 细胞在HBV 感染者外周血中的表达水平及临床意义

CD4+ CD25+调节性T 细胞在HBV 感染者外周血中的表达水平及临床意义

蒋自卫

南京中医药大学附属南京医院，临床科研中心/南京市第二医院，南京市公共卫生医疗中心, 江苏 南京 211131

【摘要】 目的 比较CD4+ CD25+ FoxP3+ 和CD4+ CD25+ CD127-/low 两种设门方法对CD4+ CD25+调节性T细胞( T reg) 细胞的界定效果, 并探讨HBV感染者外周血中T reg水平的表达及其临床意义。方法 选择慢性乙型肝炎患者74例, HBV携带者36例, 非活动性HBsAg携带者36例, 正常对照者40例, 采用CD4+ CD25+ CD127-/low设门方法用流式细胞仪进行检测, 其中正常对照组和26例慢性乙型肝炎患者同时采用CD4+ CD25+ FoxP3+设门进行检测并分析。结果 采用CD4+ CD25+ CD127-/low设门方法检测外周血T reg与CD4+ CD25+ FoxP3+设门方法在正常组和患者组均呈正相关( r=0.408, P<0.05; r=0.756, P< 0.01) 。以CD4+ CD25+ CD127-/low设门检测慢性乙型肝炎患者组、HBV携带者组、非活动性HBsAg携带者组和正常对照组外周血T reg 的水平分别为(11.45±3.86) %、(9.56±3.04) %、(7.75±2.04) %和(8.33±2.37) % 。慢性乙型肝炎患者组明显高于其他三组( P<0.01) , 慢性HBV携带者组明显高于对照组( P<0.05) , 非活动性HBsAg携带者组与对照组之间差异无统计学意义。慢性乙型肝炎患者及慢性HBV 携带者Treg 表达水平与HBV 病毒载量之间均无相关, 慢性乙型肝炎患者T reg表达水平与ALT之间无相关, HBeAg阳性患者组和HBeAg阴性患者组的T reg表达水平差异无统计学意义。结论 CD4+ CD25+ CD127-/low设门方法检测外周血Treg与CD4+ CD25+ FoxP3+设门方法有较好的相关性, 而前者更为简单、实用。T reg在慢性乙型肝炎患者、慢性HBV携带者中明显增高, 提示T reg在乙型肝炎慢性化机制中发挥重要作用。

【关键词】 CD4+ CD25+调节性T细胞; CD127; FoxP3; 慢性HBV感染

CD4+ CD25+调节性T细胞(Treg) 是近年来发现的具有自身免疫无能和免疫抑制特性的CD4+T细胞亚群, 能抑制CD4+ 和CD8+T细胞的活化、增殖及其细胞因子的分泌[ 1]。有研究表明Treg 在乙型肝炎的发病机制中起关键作用, 抑制免疫功能, 引起乙型肝炎的慢性化[ 2-3] , 但目前对健康人及慢性乙型肝生患者外周血Treg 频率的报道并不一致, 且对无症状携带者报道相对较少。既往研究中, 对Treg细胞的检测多采用CD4+ CD25hi 、CD4+ CD25+ FoxP3+的分析方法, 近年来, 有学者提出以CD4+ CD25+ CD127-/low作为表面标志对T reg细胞进行界定[4] , 但它们对T reg细胞的界定效果如何, 尚待进一步研究。为探讨以上方法对Treg的界定效果及阐述HBV感染者外周血CD4+ CD25+ T reg的表达水平, 我们用流式细胞仪检测慢性乙型肝炎患者、HBV 携带者、非活动性HBsAg 携带者、正常对照者外周血中T reg 表达水平, 并且就其与临床指标的相关性进行分析。

资料与方法

一、研究对象

病例组: 选择2020年10月至2021年6月南京市第二医院收治的慢性乙型肝炎患者74例, 其中男42例, 女32例, 平均35.2岁; HBV携带者36例, 其中男23例, 女13例, 平均35岁; 非活动性HBsAg 携带者36例, 其中男25例, 女11例, 平均32岁; 诊断标准按照2005年全国病毒性肝炎会议制定的《慢性乙型肝炎防治指南》。入选病例1年内未接受免疫调节和抗病毒治疗, 无合并HAV、HCV、HDV、HEV 等病毒感染的实验室证据。排除酒精性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝炎等其他肝炎; 排除肿瘤、自身免疫性疾病、其他感染性疾病及心血管疾病。正常对照36例来源于同一时期我院健康体检人群,其中男性19例, 女性17例, 平均35.8岁。入组病例及对照均经酶联免疫吸附法检测HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc, 实时荧光定量PCR检测血清HBV DNA载量。

二、主要试剂及仪器

CD4-PeCy5 ( Code NO: MHCD0406 ) 、CD25-PE( Code NO: MHCD2504) 由Invitrogen 公司提供; CD127-FITC( Clone: Ebiordr5) 、FoxP3-AF(Clon: PCH101) 和各自的同型对照Mouse IgG1-FITC IgG1 J Isotype Control(Clone: P3) 和Rat IgG2a-AF IgG1 J Isotype Control( Clone: eBm2a) 由eBioscience公司提供。染色Buffer和破膜Buffer (Fixation/ Parmeabillization) ( Lot: E030882)均由eBioscience公司提供。FACSCalibur流式细胞仪,美国BD公司产品, 用CELLQuest 软件(BD公司) 获取和分析实验数据。

三、方法

流式细胞仪检测CD4+ CD25+ CD127-/low T reg 所有受试者均于清晨空腹状态下抽取肝素抗凝外周血,混匀, 取全血100 LL, CD4-PeCY5 和CD25-PE 各5 LL、CD127-FIT C 10 LL ( 同型对照用Mouse IgG1-FIT C 10 LL) , 震荡混匀, 避光放置20 min; 加入溶血素2mL, 震荡, 避光放置10 min。离心, 弃上清。加入PBS 2 mL 洗涤, 弃上清, 加入PBS 100 LL, 震荡混

匀, 选择CD4+ CD25+ CD127-/low细胞群作为T reg 的表型鉴定, 分析其占CD4+T细胞百分比。

流式细胞仪检测CD4+ CD25+ FoxP3+ T reg 所有受试者均于清晨空腹抽取肝素抗凝外周血, 混匀, 用Ficoll 分离外周血单个核细胞, 用PBS 洗涤、重悬。取上述细胞100LL, 加入CD4-PeCy5、CD25-PE 各5LL( 同型对照加入IgG1-PE 10LL ) , 混匀, 室温避光20 min。加入冰染色Buffer 1mL, 离心弃上清。加入新制备的固定/ 破膜工作液1mL, 4e 避光30 min。加2mL稀释破膜Buffer 洗涤2次。用2%的大鼠血清( 破膜Buffer稀释) 100 LL, 4e封闭15min。加入抗人FOXP3-AF 20LL ( 同型对照加入IgG2a-AF1 LL) 4e , 避光30min。加入2mL 破膜Buffer 洗2次, 加入0.5mL 染色Buffer 混匀。选择CD4+ CD25+ FoxP3+ 细胞群作为T reg 的表型鉴定, 分析其占CD4+T细胞百分比。

四、统计学处理

采用SPSS16.0软件, 计量资料采用均数±标准差进行统计描述。使用独立样本t检验和单因素方差分析,经方差齐性检验后, 方差齐时采用LSD法, 方差不齐时采用秩和检验, 相关分析采用Pearson相关性检验。

结果

一、CD4+ CD25+ FoxP3+设门和CD4+ CD25+ CD127-/low设门对不同人群Treg的检测

采用不同分子标记物对正常人群和慢性乙型肝炎患者的T reg进行检测, 结果发现, 两种不同的设门方法所测得CD4+ CD25+ T reg 细胞占CD4+T 细胞百分比均高于正常对照组( P< 0.01) 。以CD4+ CD25+ CD127-/low 设门方法与CD4+ CD25+ FoxP3+ 相比较在正常对照组和患者组差异均有统计学意义( P<0.05) 。以CD4+ CD25+ FoxP3+设门和CD4+ CD25+ CD127-/low 设门的方法对T reg 检测的相关性分析显示, 两种设门方法检测结果明显正相关, 其中两种方法对正常对照组检测相关系数为r= 0.506, P< 0.05,对慢性乙型肝炎患者组检测结果相关系数为r =0. 556, P<0.01( 见表1) 。

表l 流式细胞技术不同设门方法对T reg细胞的检测结果比较

组别                               例数             CD4+ CD25+ FoxP3+设门                CD4+ CD25+ CD127-/low设门

正常对照组                   25                    5.75±1.58                                        7.33±1.17

慢性乙型肝炎患者      21                   7.74±3.07*                                      10.65±3.09*

与对照组比较 *p<0.01

二、各组外周血CD4+ CD25+ CD127-/low T reg的检测

应用流式细胞术对不同类型HBV 感染者T reg进行检测, 结果发现, 慢性乙型肝炎患者组外周CD4+ CD25+ CD127-/low T reg 的水平( 10.65±2.86) 明显高于其他三组( P< 0.01) , 慢性HBV 携带者组( 8.56±2.01) 明显高于对照组( P< 0.05) , 非活动性HBsAg携带者组( 8.75±3.04) 与对照组( 7.33±1.17) 间差异无统计学意义。

三、T reg 表达水平与临床相关指标相关性

慢性乙型肝炎患者组T reg 表达水平与HBV 病毒载量之间无相关性, 慢性HBV 携带者组与HBV 病毒载量之间也无相关。HBeAg 阳性患者组( 11.0±2.34) 和HBeAg阴性患者组(10.48±2.68) 的T reg表达水平差异无统计学意义。慢性乙型肝炎患者Treg表达水平与ALT之间无相关性。

讨论

目前认为, T reg主要通过分泌抑制性因子和细胞-细胞间直接接触介导抑制作用[ 6-7] 。近年来有关Treg在慢性HBV 感染者发病机制中的作用研究报道较多, 但结果存在较大差异, 多数认为T reg表达升高, 也有认为无差别[ 2-3, 8]。究其原因首先考虑T reg的界定方法不同, 最初选用高表达CD25(CD25hi) 的细胞群, 这样得到的Treg组分可能会不完整, 因为经免疫激活的效应性T 细胞CD25的表达也会上调, 从而很难区分Treg和效应性T 细胞, 而且关于T reg的CD25高表达界限, 各研究小组也不相同, 可能导致结果各不相同。转录因子Foxp3 特异性高表达在T reg上, 并与它的分化发育及功能成熟密切相关, 在一定程度上可反映T reg 的水平和功能活性[ 9-11 ] 。Liu等[ 4] 研究表明, CD127 低表达与Foxp3 表达有高度一致性, 检测CD4+ CD25+CD127-/low T 细胞可更加精确地反映CD4+ CD25+T reg 的百分比。本研究证实, 以CD4+ CD25+ FoxP3+设门和CD4+ CD25+ CD127-/low设门方法检测结果有较好的相关性, 但以CD4+ CD25+ FoxP3+设门检测结果显著高于CD4+ CD25+ CD127-/low设门检测结果。考虑原因可能为:(1) CD4+ CD25+ CD127-/low细胞群中有一部分FoxP3 为阴性; (2) CD4+ CD25+ FoxP3+ 设门的方法采用的是分离单核细胞后, 进行胞内染色, 而CD4+ CD25+ CD127-/low 采用的是全血的检测方法, 导致两者的差异。由于FoxP3为胞内蛋白, 需要固定、穿孔、染色,以FoxP3 作为表面标志势必影响调节性T 细胞的分离培养和功能分析, 故我们后续研究均以CD4+ CD25+ CD127-/low 作为T reg细胞的表面标志。研究发现, T reg可以通过抑制HBV特异性的CD8+ T细胞的激活, 一方面抑制过度免疫病理损伤,另一方面有利于病毒的持续感染, 在乙型肝炎的发病机制中起关键作用[ 3, 5] 。本研究表明, 慢性乙型肝炎患者组、慢性HBV携带者组中T reg表达率明显高于对照组, 非活动性HBsAg 携带者组与对照组间差异无统计学意义。慢性乙型肝炎患者、慢性HBV 携带者体内异常的T reg水平可能是导致乙型肝炎患者免疫耐受原因之一, 使得HBV不能有效清除, 导致感染慢性化。我们发现慢性乙型肝炎患者组T reg 表达水平与HBV病毒载量之间无相关性, 慢性HBV携带者组与HBV 病毒载量之间也无相关性。HBeAg阳性患者组和HBeAg阴性患者组的T reg表达水平差异无统计学意义, 提示Treg 表达水平与HBV 复制是否活跃无相关关系。本研究亦未发现慢性乙型肝炎患者T reg表达水平与ALT之间相关, 究竟是何原因导致T reg在HBV感染者中表达上调, 值得我们下一步大样本调查及动态随访深入研究。

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作者简介：蒋自卫（1983—），男，硕士研究生，南京中医药大学附属南京医院（南京市第二医院）临床科研中心助理研究员，主要从事病原微生物感染的免疫学发病机制研究 E-mail:john5340790@163.com

作者简介：蒋自卫（1983—），男，硕士研究生，南京中医药大学附属南京医院（南京市第二医院）临床科研中心助理研究员，主要从事病原微生物感染的免疫学发病机制研究 E-mail:john5340790@163.com