CIA模型大鼠主要脏器病理改变的研究

CIA模型大鼠主要脏器病理改变的研究

许昕玥1 *胡梦青2* 张洋清1孙杨婷1陈欣雨2李佳怡1卢荻1 万佳文1 董晶剑1朱文静1王吉锡1 孟丹1

1.嘉兴学院 医学院，浙江嘉兴314001；2.嘉兴南湖学院 浙江嘉兴 314000

摘要：目的 探究胶原诱导性关节炎大鼠心脏、肝脏、肾脏、空肠、回肠、结肠等脏器的病理改变。方法 建立胶原诱导型关节炎大鼠模型,对CIA大鼠的心脏、肝脏、肾脏、空肠、回肠、结肠等组织进行组织采集、包埋、切片以及HE染色。结果 肠道发生病理改变，心脏、肝脏、肾脏无明显异常。结论 RA是一种系统性自身免疫性疾病，导致机体出现炎性反应。

关键词：胶原诱导性；类风湿性关节炎；冰冻切片；HE染色技术

类风湿关节炎(RA)是一种免疫炎症性疾病,常常导致关节疼痛和僵硬,关节结构性损伤及功能性残疾[1]。在研究RA的过程中，需要有效的RA动物模型[2]。由于CIA模型的发病机制、临床表现、病理改变特点及免疫学相关指标与人RA有很多的相似性，CIA模型是目前研究RA的理想模型[3]。本文通过Ⅱ型胶原乳剂免疫诱导的方法制备大鼠CIA模型，并研究其主要脏器的病理改变。

1材料与方法

1.1实验动物

健康SPF级Wister大鼠16只，200±20g，雌雄各半，来自于杭州维通利华实验动物技术有限公司, 饲养于嘉兴学院医学院实验动物中心标准化动物房。实验严格遵守实验动物福利的“3R”原则。

1.2仪器设备

Leica CM1950 冷冻切片机（德国Leica公司）; 正置荧光显微镜（日本Olympus公司）

1.3主要试剂

CFA、牛Ⅱ型胶原蛋白、10%水合氯醛、4%多聚甲醛、磷酸二氢钠、蔗糖、磷酸氢二钠、冷丙酮、Harris苏木精染液、1%盐酸乙醇分化液、80%乙醇、伊红、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯、中性树胶、OCT冷冻包埋剂。

1.4实验方法

1.4.1动物造模

实验大鼠适应性常规饲养7 d。造模方法：胶原诱导型关节炎大鼠模型建立分为初次免疫与加强免疫。初次免疫，在大鼠足垫、尾根部进行胶原乳化剂的皮下注射, 每只大鼠0.3ml。初次免疫后7d，进行加强免疫，在大鼠足垫、尾根部进行皮下注射胶原乳化剂, 每只大鼠0.1ml。初次免疫后第14d进行关节炎评分，关节炎得分计算办法为：0分，足爪外观正常或无炎症；1分，足趾关节肿胀或轻度发红；2分，足趾关节和足跖发红并且肿胀；3分，踝关节以下的整个脚爪全部发红并且肿胀；4分，踝关节严重发红且肿胀，关节有变形迹象。

1.4.2组织采集

大鼠腹腔注射过量水合醛液麻醉致死，在30min以内取出心脏、肝脏、肾脏、空肠、回肠、结肠等组织，以保证组织的新鲜程度。

1.4.3组织包埋及速冻

新鲜采集的组织用4%多聚甲醛溶液固定2h后转移进入15%的蔗糖溶液中进行脱水，12h后换入20%蔗糖溶液，再过12h后移入30%蔗糖溶液，24h后观察组织是否沉底，沉底后使用OCT液氮包埋组织，等待OCT完全凝固，凝固后-80℃保存。

1.4.4切片

针对大鼠各脏器的切片采用不同冷冻温度，如肝脏、肾脏、脾脏组织因不含脂肪组织或组织结构较疏松，质地细腻，一般箱体温度选取-20~-18℃,冻头温度-16，肠道因组织质软,冷冻的箱体温度要求在-24~-22℃。适当调整切片机温度后，对大鼠心脏、肾脏、空肠、回肠、结肠等冰冻组织进行切片。

1.4.5 HE染色

冷丙酮固定15min，蒸馏水5min，苏木素2min，自来水10 min，分化液10，自来水10～15 min，80%乙醇10s，伊红15s，95%乙醇(Ⅰ) 10s，95%乙醇(Ⅱ)10s，无水乙醇(Ⅰ) 1 min，无水乙醇(Ⅱ)1 min，二甲苯(Ⅰ) 2 min，二甲苯(Ⅱ)2 min，中性树胶封固，显微镜观察。

2结果

2.1 CIA大鼠一般情况

正常对照组大鼠精神状况好，毛发光亮，活动自如。CIA大鼠组精神状况不佳，毛发色泽暗淡粗糙，足部红肿，活动不便。

2.2 CIA大鼠肠道HE染色

CIA大鼠肠粘膜损伤，肠绒毛部分脱落，黏膜上皮细胞出现大量炎性细胞、淋巴细胞浸润，上皮细胞可见细胞间质水肿，界限不清。

图1 肠道HE染色结果（A：回肠；B：空肠；C：结肠）

2.3 心脏HE染色

正常大鼠心肌纤维细长，结构清晰，CIA大鼠心脏病理与正常大鼠相似，无明显异常。

图2心脏HE染色结果（A：对照；B：模型）

2.4肝脏 HE染色

对照组肝细胞形态正常，结构完整，排列规则，肝小叶结构完整。模型组与正常对照组对比，形态无异常，无肝细胞变性坏死。

图3肝脏HE染色结果（A：对照；B：模型）

2.5肾脏HE染色

正常大鼠肾组织肾小球、肾小管等形态正常，CIA大鼠肾脏组织部分各结构完整，无明显异常。

图4肾脏HE染色结果（A：对照；B：模型）

3讨论

RA是一种系统性自身免疫性疾病，可以产生一系列免疫代谢紊乱，破坏机体内环境，导致炎性反应[4]

。本实验病理结果显示，除肠道有明显改变外，心脏、肝脏、肾脏均无明显变化。

本实验显示肝脏无形态异常，结合相关研究[5]说明胶原诱导性关节炎模型的建立对肝脏无明显不良影响。

造模后，肠黏膜上皮细胞可见细胞间质水肿，界限不清，细胞肿胀、坏死，提示造模对大鼠肠道造成炎性损伤。现已知CIA模型是通过佐剂乳化的Ⅱ型胶原皮下免疫注射诱导实现的[6]。另有研究[7,8]显示人参多糖、猪苓多糖以及诃子水提物对CIA大鼠肠道黏膜免疫应答有改善，说明CIA大鼠对肠道黏膜与免疫机能存在不同程度的伤害。已知肠道是机体重要免疫器官，有研究表明肠道黏膜免疫功能紊乱是类风湿关节炎发病机制之一，多种炎性细胞因子损害肠上皮细胞屏障功能，导致肠黏膜通透性增高，破坏肠道黏膜屏障[9]。通过诱导黏膜免疫耐受,调节肠道黏膜免疫功能,下调Th1或上调Th2水平,可控制RA病情活动[10]。

参考文献:

[1]苏云龙,王雪梅.胶原诱导性类风湿关节炎大鼠模型制备及早期表现评价[J].内蒙古医科大学学报,2020,42(01):53-55+58.

[2]郭帅,褚小磊,沈桐,李季,王浩淼,朱毛妮,朱盼盼,陈一航,吕樵岚,胡玲莉,田亚兰,王元元,陈传好.两种佐剂制备CIA大鼠模型的效果比较[J].蚌埠医学院学报,2022,47(03):281-284.

[3]刘佳维,李艳彦,王永辉.类风湿关节炎的实验动物模型研究进展[J].世界最新医学信息文摘,2016,16(64):35-36.

[4]李振彬,焦爱军,刘文萍,贺占国,徐峥,马旭.三七总皂苷配伍雷公藤多苷对胶原诱导关节炎大鼠心血管损伤的保护作用[J].解放军医药杂志,2015,27(01):52-55.

[5]刘乐. 雷公藤不同时间给药对胶原诱导关节炎大鼠肝功能损伤的探讨[D].华北理工大学,2017.

[6]周颖芳,刘步平,秦媛怡,龚宇,陈文裕,林芷君.2种品系大鼠Ⅱ型胶原诱导关节炎模型的比较[J].广州中医药大学学报,2018,35(06):1095-1098.

[7]刘君,董秋梅,吴昊,贾丽芬,贺斌.诃子水提物对CIA模型大鼠肠道免疫机理研究[J/OL].中华中医药学刊:1-13.

[8]张皖东,吕诚,赵宏艳,陈士林,杨大坚,吕爱平.人参多糖和猪苓多糖对CIA大鼠肠道黏膜免疫细胞功能的影响[J].细胞与分子免疫学杂志,2007(09):867-868+871.

[9]崔玉晶,高佩,文娟,OKYERE Kumi Samuel,胡延春.紫茎泽兰对大鼠肠道结构和肠道黏膜免疫屏障的影响[J].草业学报,2022,31(06):211-220.

[10]孙慧慧,罗嗣雄,刘永芳,莫美玲,雷蕾,陈延强.基于“脾为之卫”理论探讨肠道黏膜免疫与类风湿关节炎的中医机制[J].中医学报,2021,36(03):506-510.

[11]樊媛芳,徐颖,苏晓慧,刘立玲,田雅格,赵元,孔祥英,林娜.雷公藤多苷片对Ⅱ型胶原诱导性关节炎雄性大鼠生殖毒性的影响[J].中国中药杂志,2020,45(04):755-763.

[12]樊媛芳,徐颖,苏晓慧,刘立玲,田雅格,赵元,孔祥英,林娜.雷公藤多苷片对Ⅱ型胶原诱导性关节炎雌性大鼠生殖毒性的影响[J].中国中药杂志,2019,44(16):3486-3493.

[基金项目] 1.嘉兴学院大学生科研训练计划（SRT）（CD8517211477）（CD8517211475）（CD8517211474）

2.嘉兴南湖学院大学生科研训练计划（SRT）（8517213203）（8517213202）

3.浙江省大学生科技创新活动计划(新苗人才计划)（2021R417022）

4.嘉兴学院实验室开放基金项目（JJ202019）

*为共同第一作者。