酶联免疫斑点试验检测技术应用于血液病合并痰涂片抗酸杆菌阴性结核病诊断价值评价

酶联免疫斑点试验检测技术应用于血液病合并痰涂片抗酸杆菌阴性结核病诊断价值评价

李作恒,张群

安徽省淮南东方医院集团凤凰医院检验科    邮编232001

安徽省淮南东方医院集团潘三医院检验科       邮编232096

摘要：目的：分析对血液病合并痰涂片抗酸杆菌阴性结核病的患者进行酶联免疫斑点试验检测技术诊断的效果。方法：在2018年3月-2020年3月之间，本院选择60例患者，分别应用ELISPOT、结核菌素试验、抗结核抗体检测的方法进行检测，观察各种检测方式的阳性率，进行比较。结果：血标本与肺泡灌洗液ELISPOT，阳性率大致相同（P>0.05）；ELISPOT阳性率高于抗结核抗体检测以及结核菌素试验（P<0.05）。结论：ELISPOT对血液病合并痰涂片抗酸杆菌阴性结核病的诊断具有积极作用。

关键词：结核病；诊断；酶联免疫斑点试验；血液病；痰涂片；抗酸杆菌阴性；价值评价

    结核病（TB）是一种常见的慢性传染病，其传播方式以呼吸道传播为主，主要的病原菌是结核分支杆菌（MTB）。机体罹患结核病时，体内主要发生细胞免疫，细菌快速大量增生，通过引起机体的免疫损伤和炎症反应致病[1]。血液病患者通常自身免疫力较低，易发生结核病，由于其症状不典型，传统的诊断方法多为阴性，所以这为结核病的确诊带来了很大的困难[2]。ELISPOT对诊断血液病合并结核病的患者具有较高的特异性和敏感性。本次研究欲分析ELISPOT对痰涂片抗酸杆菌阴性结核病合并血液病患者的诊断效果，将选取在2018年3月-2020年3月之间60例新生儿科的病例进行观察。

1资料与方法

1.1一般资料

经患者同意和医院批准实施，在2018年3月-2020年3月之间，本院选择60例患者。其中男31例，女29例，年龄20-65岁，平均（48.23±9.35）岁，良性血液病患者有15例，免疫性血小板减少性紫癜6例，系统性红斑狼疮3例，再生障碍性贫血4例，骨髓纤维化2例；恶性血液病患者45例，急性白血病37例，淋巴瘤7例，骨髓异常增生综合征1例。纳入标准：在我院进行治疗的痰涂片抗酸杆菌阴性的结核病合并血液病的患者且对本次研究知情、同意。排除标准：病人不希望暴露个人隐私，不愿配合沟通。

1.2方法

1.2.1ELISPOT

分别取肺泡灌洗液和外周血标本各4毫升，使用淋巴细胞分层液的方式对其进行分离，便于调整分离后的细胞浓度，最终得到浓度为2.0×106/ml的单个核细胞（PMBC）悬液。向阳性对照孔加入植物血凝素（Phytohemagglutinin，PHA）50μl，阴性对照孔中加入完全细胞培养液50μl，测试孔加入50μlCFP10-ESAT6融合蛋白。分别向各孔中加入2×105个PCMC,也就是100μl之前制备的悬液，之后将微量板放置在37度的孵箱中20小时，孵箱中的二氧化碳浓度为5%；20h后去除上清液，进行4次洗板操作，使用200×PBS进行洗板，之后向每孔加入稀释过的IFN-γ检测抗体，稀释为1:60，加入50μl，孵育2小时，温度为37摄氏度；再次洗板后，于各个孔加入1:1000稀释的链亲和素-碱性磷酸酶50μl，孵育2小时，于室温下孵育；再次洗板，加入刚配好的BICP/NBT底物50μl，进行15min的显色；这是可以观察的板底出现紫色的斑点，使用蒸馏水洗板。使用酶联斑点分析仪进行着色斑点的计数。当阴性对照孔点数大于等于8时，做检测孔点数是阴性对照孔点数的两倍，则标本为阳性；当阴性对照孔点数小于8时，检测孔点数减去阴性对照孔点数大于等于8，则标本为阳性。

1.2.2结核菌素皮肤试验

注射结核均素纯蛋白衍生物（Purified Protein derivativeTuberculin,PPD）0.1ml于左前臂1/3处的内侧皮肤，当注射部位出现皮丘时说明注射成功，于三天后观察红肿或硬结的直径，若大于等于5毫米则为阳性。

1.2.3抗结核抗体检测

1.3观察指标

    观察并分别记录不同检测方法所检测出的痰涂片抗酸杆菌阴性的结核病患者中阳性的病例数，并计算阳性率，进行对比。

1.4统计学方法

运用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析，等级资料采用秩和检验；计数资料用率（％）表示，采用校正X2检验；计量资料采用独立样本t检验，P＜0.05时表示差异在统计学上有意义。

2结果

2.1血标本与肺泡灌洗液ELISPOT

使用血标本进行ELISPOT检测的患者中，阳性率为88.33%，使用肺泡灌洗液进行ELISPOT检测的患者中，阳性率为86.67%，血标本与肺泡灌洗液标本阳性率相差不大，差异无统计学意义，P>0.05，见表1。

表1.血标本与肺泡灌洗液ELISPOT检测

2.2各种检测方式对比

使用ELISPOT检测方式进行检测，阳性标本数为53人，阳性率88.33%，使用结核菌素试验检测方式进行检测，阳性标本数为32人，阳性率53.33%，使用抗结核抗体检测方式进行检测，阳性标本数为23人，阳性率38.33%，ELISPOT检测方式阳性率远高于其它两种方式，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2.

表2.各种检测方式对比

3讨论

MTB主要的传播途径是经飞沫进入呼吸道传播，也可侵入神经系统、骨、肾、肠、肺等组织器官，引起肠结核，骨结核等疾病，最常见的是肺结核。多数患者感染MTB时没有明显的症状，TB的发病主要取决于细菌的数量、细菌的毒力、被感染机体的免疫状态。血液病患者的免疫力较差，且可能使用一些抑制免疫功能的药物，所以决定患者较正常人更易感染MTB，且被感染后症状不明显。

目前，虽然诊断技术不断提高，但对于结核病的检测仍有一定的局限性。ELISPOT是当前检测抗原特异性T细胞最敏感的方法之一。科学家于1996年在结核分支杆菌中发现了一段基因序列，为RD1，这种基因序列存在于结核分枝杆菌中，但不存在于卡介苗菌株和大多数环境中的分支杆菌中，所以RD1特异性很高。此基因序列编码两种蛋白：10KD培养滤过蛋白（culture filtrate protein-10,CFP-10）肽段以及6KD早期分泌靶向抗原（early secreting antigen target-6,ESAT-6）。这两种蛋白只在结核分枝杆菌的菌群之中发现，由于这两种蛋白是T细胞的把抗原，所以它们可以刺激外周血单核细胞产生细胞因子IFN-γ并且诱使皮肤发生超敏反应。使用这一原理进行的ELISPOT技术可以用于临床上MTB的诊断。这种检测技术具有快速，灵敏度高，特异性高的优势，缺点是价格较昂贵，难以应用于结核病的普查。

在本次研究中，血标本与肺泡灌洗液标本阳性率相差不大，说明对于ELISPOT检测，使用血标本和肺泡灌洗液可得到相差不多的结果；ELISPOT检测方式阳性率远高于其它两种方式，说明ELISPOT检测更为灵敏，阳性率高。

综上所述，对血液病合并痰涂片抗酸杆菌阴性结核病的患者，采用ELISPOT检测，对患者疾病的诊断具有积极作用。

参考文献：

[1]陆群,金婷.T细胞酶联免疫斑点法在诊断肺癌合并肺结核中的应用及有效性分析[J].中国肿瘤临床与康复,2019,26(10):1177-1180.

[2]刘建华,崔振鹏,张礼军,等.γ-干扰素酶联免疫斑点法联合结核菌素试验在附睾结核诊断中的应用价值[J].实用临床医药杂志,2019,23(20):63-65+69.