纳米氧化铈在阿霉素诱导的心肌损伤中的抗氧化作用的研究

纳米氧化铈在阿霉素诱导的心肌损伤中的抗氧化作用的研究

文英[1] ,蔺雪峰[2] ,韩轩茂2

( 1．内蒙古科技大学包头医学院研究生学院，内蒙古 包头   014060 ；

2．内蒙古科技大学包头医学院第一 附属医院心内一科，内蒙古 包头   014040)

[摘要]目的：为有效治疗阿霉素（DOX）引起的心肌损伤提供理论依据，并探讨氧化铈（CeO2）纳米颗粒对DOX损伤诱导的心肌细胞抗氧化作用的影响。方法：选择H9C2大鼠心肌细胞，将其分为五组：正常组，模型组（阿霉素组），纳米氧化铈组，纳米氧化铈+阿霉素组，右丙亚胺+阿霉素处理组。制备DOX损伤大鼠心肌细胞模型，以探讨和分析CeO2对于DOX损伤的心肌细胞是否有抗氧化作用。结果：DOX处理组的 ROS 水平较对照组有显著性升高（p<0.05），CeO2 预处理能够减少DOX造成的 ROS 增加，且具有统计学意义（p<0.05）。结论：CeO2对阿霉素诱导的大鼠心脏毒性的氧化应激有着抗氧化作用，显示出可靠的临床意义。

[关键词]纳米氧化铈；阿霉素；活性氧；

氧化铈(CeO2)作为一种稀土氧化物，由于其表面存在大量的离子空位，使Ce3+离子聚集在粒子表面，逐渐进入人们的视线[1]。它以三价(+3)和四价(+4)两种状态存在，并可能在两种状态之间发生氧化还原反应。CeO2等纳米颗粒已经成为潜在的治疗剂，可用于包括癌症在内的各种氧化应激疾病。阿霉素( Doxorubicin，Dox)，是一种 I 类非选择性蒽环类抗[2]生素，Dox 作为一种有效的化学治疗剂，广泛用于恶性肿瘤治疗的药物。但是DOX被认为是化疗引起心脏毒性的主要罪魁祸首，经过多个研究认为氧化应激在心脏毒性中起着核心作用[3]。阿霉素的毒性与其产生 ROS，引起氧化应激状态有关。因而，我们对纳米氧化铈（CeNPs）能否减少阿霉素诱导的 ROS 产生进行了探索。本研究用阿霉素诱导大鼠 H9C2 心肌细胞凋亡。研究 CeNPs对H9C2 心肌细胞凋亡中的作用及机制。

1.实验材料和方法

1.1.材料

H9C2心肌细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司）；细胞专用培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司）；细胞CO2培养箱（Panasonic）；流式细胞仪（Novocyte）；倒置光学显微镜（日本奥林巴斯）；成像系统（明美Mshot）；T25贴壁细胞培养瓶，细胞培养板（JET BIOFIL）；盐酸阿霉素（上海源叶生物科技有限公司）；氧化铈（Sigam）;DMEM培养基，双抗（Gibco）；血清（四季青）；胰酶（Solarbio）；PBS缓冲液（云克隆）；活性氧（ROS）检测试剂盒（翊圣生物）；

1.2实验分组

A）正常组：H9C2心肌细胞在正常培养基条件下培养24小时           

B）模型组：用含 1 μmol/L 阿霉素的培养基处理细胞 24 小时

C）纳米氧化铈组：用含10ug/ml 纳米氧化铈的培养基处理细胞24小时

D）纳米氧化铈+阿霉素组：用含10ug/ml 纳米氧化铈和1umol/L阿霉素的培养基共同处理细胞24小时

E）右丙亚胺+阿霉素处理组：用含10umol/L右丙亚胺和1umol/L阿霉素的培养基共同处理细胞24小时。

1.3细胞培养和治疗

H9c2细胞在补充有10%(体积百分比)胎牛血清、2 mL谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM中培养。在37℃下，将细胞培养在含有95%空气和5% CO2的湿润培养箱中。在所有实验中，将细胞以适当的密度铺板，并在进行各种处理之前培养36小时。细胞被分成五组。对照组和DOX组用DMSO(终浓度< 0.1%)处理。CeNPs (10μg/mL)和1μmol/L DOX共处理24 h。

1.4 流式ROS检测

取对数生长期细胞，胰酶消化调整细胞密度为1×106/ml，种于6孔板内，每孔2ml，将6空孔板置于培养箱中继续培养，待细胞汇合度达到80 %~90 %时，按实验分组处理后收集细胞，按以下步骤进行ROS检测。

（1）胰酶消化细胞，800rpm离心 5min，去掉上清，沉淀细胞。

（2）加入约 1ml 4℃ 预冷的 PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，加PBS重悬。

（3）按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，使其细胞密度为1.0×106。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。

（4）用无血清细胞培养液洗涤细胞2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

（5）细胞沉淀用300μL的PBS重悬

（6）流式上机检测: DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。

1.5统计学处理

对本次研究采用 SPSS２6.０统 计软件对数据进行分析与处理，两组间比较采用独立样本ｔ检验，规范化治疗前后使用两配对样本ｔ检验，以 Ｐ＜0.05时差异具有统计学意义。

2.实验结果

DOX处理组的 ROS 水平较对照组有显著性升高（p<0.05）,CeO2预处理能够减少阿霉素造成的ROS增加,且具有统计学意义（p<0.05）。

图1：CeO2对阿霉素造成的 ROS 增加的影响。

讨论

癌症是当今威胁人类的最危险的疾病之一是一个重大的公共卫生问题，给社会及家庭带来了重大负担。阿霉素可以用于以下肿瘤：急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、霍奇金病、神经母细胞瘤、肉瘤和骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、膀胱移行细胞癌、胃癌、甲状腺癌、恶性淋巴瘤和小细胞型支气管肺癌[4]。然而严重的副作用限制了 阿霉素使用，其中最明显的是心脏毒性，可导致左心功能不全，扩张型心肌病和心脏衰竭。大多数研究表明阿霉素心脏毒性的机制表现在：增加的反应活性氧（ROS）水平、线粒体功能障碍、凋亡和自噬的改变、过氧亚硝酸盐的形成以及心肌细胞钙超载。大量氧自由基产生导致心肌细胞脂质的过氧化被认为是阿霉素诱导心肌细胞损伤的主要原因之。

随着纳米技术的发展，纳米材料在此类平台中的集成备受关注，提升了它们在许多领域的功能。CeNPs作为一种真正独特的材料，在许多其他金属氧化物中脱颖而出，由于其低系统毒性和对生命系统的许多有益影响，在生物医学方面显示出巨大的潜力，并因其能够减轻由多种ROS(如超氧化物、过氧化物和过亚硝酸根)引起的氧化应激而受到特别关注[5]。主要是由于Ce3+和Ce4+的混合价状态以及氧空位的存在，特别是，Ce4+在表面部分还原为Ce3+，使CeO2具有显著的抗氧化性。已被报道CeNPs具有包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶（CAT）和氧化酶在内的多种酶的模拟性质，已经确定纳米氧化铈的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶模拟活性很大程度上取决于表面上铈离子的氧化态。

本实验采用阿霉素诱导体外培养的大鼠 H9C2 心肌细胞，检验CeNPs是否对DOX诱导的心肌细胞损伤有着保护作用，也为临床CeNPs治疗阿霉素引发的心肌损伤或慢性心力衰竭患者的治疗提供新的理论依据。

结果提示，CeNPs能有效控制心肌损伤程度，大大降低心肌细胞凋亡指数，有效保护大鼠心肌细胞。

然而，CeNPs在心肌损伤中的作用机制在临床应用中尚未完全阐明，纳米氧化铈对人体的安全性尚未得到有效验证。因此，氧化铈纳米颗粒尚未有效应用于心肌损伤的临床治疗。相关机制和安全性有待大量深入研究进一步阐明。希望随着科学技术的发展，氧化铈纳米粒子的潜力能够得到充分挖掘，从而更好、更安全地应用于临床，造福于广大患者。

[参考文献]

[1]ZONG C, WANG C, HU L, et al. The Enhancement of the Catalytic Oxidation of CO on Ir/CeO(2) Nanojunctions [J]. Inorg Chem, 2019, 58(20): 14238-43.

[2]LENNEMAN C G, SAWYER D B. Cardio-Oncology: An Update on Cardiotoxicity of Cancer-Related Treatment [J]. Circ Res, 2016, 118(6): 1008-20.

[3]SANGOMLA S, SAIFI M A, KHURANA A, et al. Nanoceria ameliorates doxorubicin induced cardiotoxicity: Possible mitigation via reduction of oxidative stress and inflammation [J]. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 2018, 47.

[4]LINA S, CUILING Z, XINXIN L, et al. Combined Photothermal Therapy and Lycium barbarum Polysaccharide for Topical Administration to Improve the Efficacy of Doxorubicin in the Treatment of Breast Cancer [J]. Pharmaceutics, 2022, 14(12).

[5]M. S M, V. P E, L. P A, et al. New facets of nanozyme activity of ceria: lipo- and phospholipoperoxidase-like behaviour of CeO2 nanoparticles [J]. RSC ADVANCES, 2021, 11(56).

[1] 在读硕士研究生

[2] 通讯作者