南京科技职业学院 南京 210048
摘要:目的:制备肝素钠软膏剂并建立制剂质量控制方法。方法:根据基质处方,采用后加乳化剂并搅拌的方法制备软膏剂基质,将药液加入基质中搅拌均匀即可制得软膏剂。用生色底物法分别测定原料药和制剂中肝素钠的抗IIa因子的效价。结果:所制得的软膏剂外观与性状符合制剂要求,软膏剂中肝素钠含量为311.15IU/g,为标示量的97.23%。结论:本文肝素钠软膏剂的制备方法可行,质量控制方法客观准确,适合实验室与医院药房少量制备肝素钠外用剂型。
关键词:肝素钠 软膏剂 生色底物法 抗IIa因子效价
肝素钠系从猪或牛的肠粘膜提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐,属粘多糖类物质,具有延长凝血时间的作用。研究表明,肝素钠除了具有抗凝活性之外,还具有抗炎、抗过敏和抗补体等药理活性[1]。软膏剂是外用法给药的剂型之一,通过皮肤、孔窍、经络及病变局部等部位治疗疾病,避免了胃肠道的破坏与肝首过效应,减少血药浓度峰谷变化,已成为克服药物副作用的有效用药途径之一。
2005年版中国药典用兔血浆法,美国药典USP30版用羊血浆法测肝素钠效价的生物测定法。中国药典2020版、美国药典USP37版收载了生色底物法测定肝素钠的效价。血浆法由于不同批号的血浆所得实验结果有可能不同,因此肝素的效价测定也应采用抗IIa因子的发色底物的分光光度法。
本文拟制备肝素钠软膏剂,并用生色底物法测定原料药和制剂中的肝素钠抗IIa因子效价,以对制剂进行质量控制。
1 试剂与仪器
UV2550/UV2700 型紫外可见分光光度计(日本岛津公司);肝素钠原料药系本实验室自制,抗IIa因子效价标示的肝素钠标准品购自惠兴生化试剂有限公司(9.5mg,2144IU)。抗凝血酶ATⅢ(Chromogenix,10IU/瓶),发色底物S-2238(Chromogenix, 25mg),Ⅱa因子(中国食品药品检定研究院,840IU/瓶),三羟甲基氨基甲烷与聚乙二醇6000 ( 国药集团化学试剂有限公司)。
2 方法
2.1 软膏剂基质处方与制备
2.1.1 软膏剂基质处方
以100g为例,单硬脂酸甘油酯 7g,甘油14 g,硬脂酸10 g,水48 g,白凡士林10 g,十二烷基硫酸钠1g,液状石蜡10g,羟苯乙酯0.1g。
2.1.2 制备工艺
将除十二烷基硫酸钠之外的所有组分置于烧杯中,水浴加热至熔化,保温于85℃。另将十二烷基硫酸钠用少量蒸馏水溶解,并保温于85℃,在搅拌下将其加入上述混合物中,搅拌至冷凝即得。
2.2肝素钠原料药效价的测定
2.2.1标准曲线的测定
标准品用纯水精确定容至25mL,得到标准品母液。分装至离心管中备用。-20℃冻存。临用前取出放置至室温。取1mL用Tris缓冲液(pH8.4)定容至50mL,再取1mL该稀释液用Tris缓冲液(pH8.4)定容至50mL,得到标准品母液的1:2500稀释液。该稀释液效价约为0.0343IU/mL,再依次制得0.0240、0.0168、0.0118 IU/mL的另外三个浓度的标准品待测液。
37℃恒温下水浴,每隔12秒顺次加入标准品待测液100μL,0.25 IU/mL的ATⅢ加入100μL,5 IU/mL的IIa因子加入200μL(过量),0.625mmol/L的发色底物S-2238加入200μL,反应终止剂50%醋酸200μL。所得反应溶液在405nm波长下测定吸光值。以浓度为横坐标,吸光值为纵坐标即得标准曲线。
2.2.2原料药效价测定
精确称取约0.3g肝素钠原料药置100ml容量瓶中,用生理盐水定容至刻度,充分混匀,作为原料药储备液。按原料药估计效价(200IU/mg),精确稀释得到约0.0240IU/mL的原料药供试品溶液。同2.2.1法测定原料药供试品溶液的吸光值,进而求算原料药效价。
2.3 肝素钠软膏剂的制备
按照2.1.2项制备软膏剂基质,软膏剂中肝素钠的标示含量为320IU/g,根据所测得的原料药效价,准确称取肝素钠原料药,用适量水(该部分水从基质中剔除)溶解肝素钠原料药,将该药液加入基质中,搅拌均匀即得。
2.4 软膏剂中肝素钠含量的测定
精密称取肝素钠软膏剂约2.5g,置100ml容量瓶中,加无水乙醇30ml,置水浴中加热溶解后,加生理盐水至刻度,摇匀,4℃放置过夜,弃去上层油脂,过滤,取滤液50ml置蒸发皿内,水浴加热至无乙醇嗅味,再移至50ml容量瓶中,用生理盐水定容至刻度,即得软膏剂储备液。精确稀释得到约0.0320 IU/mL的软膏剂供试品溶液。同2.2.1法测定原料药供试品溶液的吸光值,进而求算软膏剂中肝素钠含量。
3 结果
3.1 软膏剂基质与制剂性状
所制得的软膏剂基质与制剂皆为色泽均匀、质地细腻、涂展性良好的淡黄色乳膏。
3.2 肝素钠原料药抗IIa因子效价
标准品待测液的曲线回归方程为y= -8.7322x+0.6307(R
2=0.9916),见图1。
图1. 肝素钠效价测定的标准曲线
原料药供试液吸光值为0.433,进而求算得肝素钠原料药效价为188.67IU/mg。
3.3 软膏剂中肝素钠含量
按照3.2中所测得的肝素钠原料药的效价,精密称取0.1696g原料药,制得肝素钠软膏剂。测得软膏剂供试液吸光值为0.359, 进而求得软膏剂中肝素钠含量为311.15IU/g,为标示含量的97.23%。
4 讨论
软膏剂的基质在制备时,乳化剂的加入可以先加,也可以后加。根据文献报道,制备软膏剂基质时,以后加乳化剂并用胶体磨高剪切匀乳所得基质综合评分最好。本文中采用后加乳化剂并搅拌,所制得的软膏剂基质符合制剂要求。
肝素钠的效价测定是质量控制的关键,本文中用生色底物法测定肝素钠抗IIa因子的效价,该方法特异性好,灵敏度高,重复性好,终点指标客观,不受其它凝血因子的影响。目前我国肝素钠效价测定多采用血浆法,由于每批血浆之间存在差异,不同批号的血浆所得结果有可能不同,且实验结果依赖主观判断。生色底物法属于理化方法,而血浆法属于生物测定法,用理化方法代替生物测定法是药物质量控制中的趋势,增强科学性,减少主观判断。
总之,本文所制备的肝素钠乳剂型软膏剂符合制剂的一般要求,并且建立了生色底物分光光度测定原料药与制剂中肝素钠抗IIa因子效价的方法,从而有效地进行肝素钠软膏剂的质量控制,可供实验室少量制备或医院药房制备肝素钠外用剂型参考。
参考文献
1 王磊,焦楠,李传秋等.羊血浆法测定海普林软膏中肝素钠生物效价的探讨[J].中国生化药物杂志,2002,23(3):149-150.
2 郝士婧等.生色底物法测定肝素钠的效价[J].上海医药,2022,43(19):70~73.
3 李湛军,徐康森.低分子肝素生物活性测定方法的比较研究 [J].药物分析杂志,2005,25(9):1111-1114.