贝伐珠单抗仿制药生物活性测定方法的开发与应用

贝伐珠单抗仿制药生物活性测定方法的开发与应用

赫清雪

北京科信聚润医药科技有限公司哈尔滨分公司

【摘  要】贝伐珠单抗（vascular endothelial growth factor，VEGF）是人体血管内皮生成的重要调控因子，利用这种因子开发仿制药物，也能够改善一些肿瘤疾病对人体结构造成的血管异常现象。如一些仿制药物的应用过程中，可以与贝伐珠单抗（VEGF）的特异性结合，进而阻断肿瘤对人体血管的改变，使血管内皮细胞生长因子受体无法活化，这便能够阻碍肿瘤细胞进行生成相关血管。

【关键词】贝伐珠单抗；仿制药；测定方法

针对生物仿制药物的药效活性检测而言，主要应用的方法即基于细胞的检测方法，这种方法具有特异性高、变异度小的优点，但具体的检测过程中，通常会受到一些条件限制，如检测过程中由于操作程序复杂、实验周期长，因此，往往会伴随一些人为操作上的误差问题。基于表面离子共振技术是建立在活性检验的方法上，再进行检测，是近些年来广泛应用的小分子制药和生物制药领域中的检测技术。本文对贝伐珠单抗仿制药生物活性测定方法进行说明，并对该药物的开发及应用进行分析。相关过程如下。

1.一般材料及方法

1.1一般材料

试验用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）细胞株；基础培养液；完全培养基；生长因子；明胶。

1.2方法

1.2.1采用基于HUVEC增值抑制法活性方法进行开发。

（1）培养实验用人脐静脉内皮细胞（HUVEC），在复苏细胞的前一天采用0.25%的明胶溶液包进行培养，并将明胶放置到培养瓶中，使明胶均的布置在培养瓶的底层位置；待将人脐静脉内细胞放置到培养瓶中后，将培养瓶放置到37℃培养箱中，至少放置2h；使37℃水完全预热培养基。从液氮中取出细胞冻存管，并快速的将细胞冻存管放置于37℃水浴中解冻，解冻后放入安全柜中，将细胞转移至加好培养基的细胞培养瓶中后，应将其置于37℃、5%CO2的培养箱中。当复苏后的细胞回合度达到80%时，消化细胞并对细胞进行传代，此时可以进行冻存或者铺板。（2）贝伐珠单抗（VEGF）的浓度优化，为了使VGEF的作用充分发挥，应加强溶液浓度的研究，使得VEGF对细胞产生最大的刺激作用，进而发挥出药物的最大作用。

1.2.2基于表面等离子共振技术活性方法的开发

表面等离子共振（SPR）技术是一种基于物理光学特性的分析技术，Biacore仪器是基于SPR技术开发的新型生物传感分析仪器，本实验以Biacore为检测仪器，以贝伐珠单抗标准品为配体，以VEGF为分析物，分别按照以下条件进行稀释：配体浓度1μg/ml，分析物浓度2.5 mg/ml；配体浓度0.5μg/ml，分析物浓度2.3μg/ml；配体浓度0.25μg/ml，分析物浓度2.3μg/ml，所有单循环进样120 s，再生液为3 mol/L氯化镁。根据以上实验确定最佳多循环条件，多循环实验时，分别稀释配体及分析物至最佳浓度，分析物VEGF以最佳浓度为起始浓度，2倍稀释，7个梯度。其中，设置中间浓度及零浓度，进样120 s，解离800 s，再生液为3 mol/L氯化镁。

1.2.3VEGF仿制药样品的生物活性检测

检测过程中，按照以上HUVEC增殖抑制法建立活性检测方法，读取荧光读数（RFU），在进行绘制图曲线，对曲线进行拟合，拟合后可以得到r2值与EC50值，根据对值数字，便可以计算仿制药物的生物活性值。基于这种方法也可以得到抗原体亲和力（KD）值，同时还可以绘制出仿制药物的动力学曲线。

2.结果

2.1VEGF浓度的优化

为了使VEGF浓度适量，并最大化发挥出作用，使其对HUVEC的刺激效果更显著，实验过程对8个浓度点进行了检验测试，测试结果表明，当VEGF浓度处于30/35/40ng/ml时，HUVEC细胞均匀最大化的刺激效果。与此同时，初于对成本因素的考虑，选择30ng/ml的浓度最佳。

2.2药物样品的作用浓度、稀释倍数以及梯度的优化

优化实验中，通过不断对样品的浓度、稀释倍数、梯度的优化后，确定样品的浓度作用范围应该在3~0.0013ug/ml之间，在此范围内，8个浓度的作用点的曲线拟合度也非常良好。进一步试验研究中，取样品溶液浓度在3ug/ml，3倍稀释、8个梯度曲线浓度点分布较为理想，曲线拟合度也呈现出最佳状态，基于此，确定最佳起始浓度为3ug/ml，3倍稀释，8个梯度。

2.3对实验结果的专属性验证

专属实验结果的验证过程中，设置了以下4种溶液：TNF-α单抗、抗RANKL单抗、基础培养液（HUVEC-004B）、抗VEGF单抗。实验结果表明，只有抗VRGF单抗中容易呈现记录关系曲线，其余对照组并米业与任何VEGF结合的活性。

2.4线性与重复性验证

验证结果表明，在进行6次优化实验过程中，6次检测的r2>96%，这满足线性验证标准。重复实验中，样品EC50的RSD均小于25%。

2.5实验结果准确相验证

验证结果表明，3人在做6次检测后，生物活性值均在70%~130%之间，证明，实验结果准确性符合验证标准。

2.6基于表面等离子共振技术活性方法的开发

实验过程中，充分研究了配体及分析物的浓度，并进行了优化，结果表明，当分析物流过芯片表面所产生的响应值在50RU附近时，更为利于开发药物的活性。最终确定配体溶液的浓度为0.5ug/ml，分析物浓度为2.3ug/ml。

2.7仿制药样品的生物活性检测结果

选择原研药作为标准品，对仿制药物进行研究，利用本文提出的优化条件进行验证研究。建立基于HUVEC的增殖抑制法，对仿制药物的活性进行检测，对仿制药物的抗VEGF活性进行检测。结果表明，仿制药物与原药物的活性并无太大差异。

3.讨论

目前而言，贝伐珠单抗类药物已经被批准为上市药物，如可用利用该类药物实现对直肠癌、乳腺癌、肺癌、多形性成胶质细胞瘤等疾病的治疗。据相关医疗数据统计，当前肺癌已经成为我国及世界范围内的高发疾病，且具有较高的死亡率，如肺癌中的非小细胞肺癌最为常见，占据肺癌种类中的80%。肺癌患者每年约需要治疗费用为38万元左右，这不仅给予普通家庭带来极大的经济负担，同时该疾病也具有较低的治愈率。因此，若能够降低肺癌治疗阶段的成本，则能够为患者减轻一些经济压力，为患者的治疗提供一些方便。贝伐珠单抗生物仿制药具有与原药物相类似的药物属性，且具有更低的成本优势，因此，若这种药物若能够广泛应用于一些癌症患者的治疗过中，势必能够为患者的疾病治疗减轻一些经济负担。此外，由于一些国家及地区的贝伐珠单抗生物制品专利保护的相继到期，对于贝伐珠单抗的仿制药物而言，该药物越来越被国际社会所认可。贝伐珠单抗的仿制药物的药效判断过程中，鉴定药物活性是重要的一环。

参考文献

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