三种不同方法对余甘子中总黄酮含量测定

三种不同方法对余甘子中总黄酮含量测定

罗紫依 刘欣烨  李梦圆   宋晴雯  杨舒麟  指导教师：陈丙春

山东协和学院      山东济南

摘要：目的:分析冷浸提取法、超声波提取法、回流提取法对余甘子中的黄酮类活性成分含量的影响。方法:选取余甘子干果进行粉碎和过筛，对其粉末采用冷浸提取法、超声波提取法、回流提取法三种方法进行提取，利用NaNO2- AI(NO3)3显色法测定总黄酮含量，分析3种提取方法对实验结果的影响。结果:回流提取法为最佳提取条件，测得云南余甘子含量为404.4mg/g。结论:三种方法中，回流提取法是提取余甘子中黄酮类化合物的中最佳提取方法。

关键词：余甘子 总黄酮 含量测定

余甘子又名余甘果、油甘子，其主要药理活性成分为黄酮类、生物碱、有机酸等。黄酮类化合物，指以2-苯基色原酮为骨架衍生的一类化合物的总称。黄酮类化合物可在紫外光（359nm）及可见光（510nm)下呈不同颜色的荧光，可以用紫外可见分光光度计进行总黄酮含量检测。本研究分析冷浸提取法、超声波提取法、回流提取法对余甘子中的黄酮类活性成分含量的影响。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

试剂:无水乙醇、95%乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、芦丁标准品（纯度≥95%，CAS号153-18-4），化学试剂均为分析纯，水为蒸馏水。余甘子购自云南。

1.2仪器与设备

F-040型超声波清洗机（深圳福洋科技集团有限公司），752N型紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司），HC-30118R型高速冷冻离心机（云南中科中佳科学仪器有限公司），RS-FS1406型多功能粉碎机（合肥荣事达小家电有限公司），JJ324BC型电子天平（精度0.001，上海精胜科学仪器有限公司）。

2 方法

2.1 粉碎:取云南余甘子50g，置中草药粉碎机中粉碎，过80目筛得余甘子粉末，置干燥箱中保存备用。

2.2 提取:

2.2.1 浸渍法

称取余甘子粉末5g,加60%乙醇100mL，冷浸24h，使有效成分充分浸出。

2.2.2 超声波提取法

称取余甘子粉末各5g，各加60%乙醇100 mL，超声提取1次，在提取温度为60℃，功率为210W，提取时间为40min的条件下进行提取。

2.2.3　回流提取法

称取余甘子粉末各5g，各加60%乙醇100mL回流提取1次，提取时间为1h，提取温度为80 ℃进行回流提取。

2.3配制

2.3.1 配制芦丁标准液：精确称取10.00mg 干燥恒重的芦丁标准品，用50％乙醇溶解并定容至50mL，得0.2mg/mL 芦丁标准品；再分别精准吸取芦丁标准液0.00ml、 1.00ml、  2.00ml、3.00ml、4.00ml、5.00ml、6.00ml置25ml容量瓶中，并加50％乙醇补足至6.00mL，然后采用NaNO2- AI(NO3)3显色法测定总黄酮含量。加5%NaNO2溶液（用60%乙醇配制)1ml，摇匀静置6min后，再加10% AI(NO3)3溶液（用60%乙醇配制)1ml，摇匀静置6min，随后加1% NaOH 溶液（用60%乙醇配制)10ml，最后加50％乙醇定容，静置15min 。各上述步骤完成后，以50%乙醇为空白对照，将所得样品在510 nm 波长处测吸光值，以芦丁浓度（C）为横坐标，吸光值（A）为纵坐标，绘制标准曲线:y=mx+n其中y为黄酮溶度（mg·mL⁻¹），x为吸光值浓（A）。

2.3.2 配制待测液

将提取后各样品置差速离心机中以10000r/min离心10min，取上清液1ml，以50%乙醇定容至2ml。采用NaNO2- AI(NO3)3显色法测定总黄酮含量。加5%NaNO2溶液（用60%乙醇配制)1ml，摇匀静置6min后，再加10% AI(NO3)3溶液（用60%乙醇配制)1ml，摇匀静置6min，随后加1% NaOH 溶液（用60%乙醇配制)10ml，最后加50％乙醇定容 ，静置15min。将所得样品在510nm 波长处测吸光值，根据芦丁标准曲线测定总黄酮含量，按照公式计算:[9]

Y:所测吸光值（A）；m n:标准曲线中mn值；f:稀释倍数；V：样品提取液体积（ml)；M：余甘子粉末称取质量M=5g

3 结果与分析

3.1结果

检测结果见表2。由样品吸光度计算得总黄酮含量，可得出所测得总黄酮含量回流提取法＞冷浸提取法＞超声提取法。

表 1余甘子提取液平均吸光度及（A）

3.2分析

3.2.1不同提取方法对总黄酮含量的影响

由表2可知，三种提取方法所测得吸光度差异较大。

冷浸提取法在三种提取法中操作最简便，提取杂质也最少，但单独使用时提取时间过长（24h），时间成本远远高于回流提取法与超声提取法，且冷浸提取率低于热提取法（回流提取法与超声提取法均为热提取）。回流提取法具有提取效率高、操作简单，适用范围广，提取较完全等优点，相比较下超声提取法提取效果更好，提取率更高、提取时间更短、提取温度低（40℃～60℃），但不适用于对提取温度要求过高的一些黄酮类化合物。余甘子黄酮类化合物中含量最高的为山奈酚和槲皮素，均易溶于热乙醇，且提取率均与提取温度成正比。据高亮亮等

[1]的实验研究表明，在黄酮类化合物的提取实验中，对黄酮类化合物的提取率影响最大的为乙醇浓度与提取温度。已知本实验中回流提取法的提取温度为80℃，超声提取法的提取温度为60℃，而冷浸提取法的操作均在冷浸过程中进行，所以回流提取法的提取温度最高，超声提取法次之，冷浸提取法则最低。据田呈瑞等[2]的研究表明，70%的乙醇与黄酮的极性最相似，在此条件下黄酮类化合物的溶解度最大。高中松等[3]的研究表明，当乙醇浓度为70%时，总黄酮类物质的提取率最高，但当乙醇的浓度＞70%时，总黄酮物质的提取率反而会降低。根据肖萍等[4]的研究表明，在70%乙醇的作用下，使用超声提取法提取总黄酮的含量高于回流提取法的提取量。本次实验均使用60%的乙醇含量，未达到提取总黄酮的最佳乙醇浓度，在乙醇浓度较小的影响下，黄酮化合物的溶解度变小，则超声提取法所提取的黄酮含量也大大减少。反之，回流提取法提取温度高于超声提取法，使黄酮化合物的溶解度变大，较之超声提取法提取更加完全，所以回流提取法所提取的总黄酮含量最高。

4 讨论

实验分别使用回流提取法、冷浸提取法和超声提取法三种不同的提取方法进行，结果显示回流提取法>冷浸提取法>超声提取法，可能是实验所用乙醇浓度未达到提取黄酮的最佳浓度，导致超声提取法所提取的黄酮含量最少。

近年研究发现，余甘子除了传统的清热凉血，消食健胃，生津止渴功效，还具有抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等作用，越来越收到医学领域的重视。裴河欢[5]的研究表明，余甘子黄酮乙醇提取液和水提取液可以清除羟基自由基并抑制超氧自由基，即余甘子黄酮具有很好的抗氧化效果。通过对不同方法对余甘子进行总黄酮测定，可为余甘子的深加工及资源综合利用提供科学依据。谨以本文为今后余甘子总黄酮的分析和开发利用提供参考意义。

参考文献

[1]高亮亮，钱令芝，张霞等.女贞子中黄酮类化合物的回流提取工艺研究［J］云南科技学院学报，2020，（02）.

[2]田呈瑞，李昀.银杏叶黄酮的乙醇提取方法研究［J.］西北植物学报，2001，21（3）:556.

[3]高中松，丁文，高亮.超声波提取桑叶中总黄酮的工艺研究［J］.中国农报通学，2006，22（4）:116.

[4]肖萍，王升平，郭亦然等.不同方法提取余甘子果实和叶片中的黄酮混合物对麻疯树种子油的抗氧化性比较［J］.四川大学学报（自然科学版），2013（05）.

[5]裴河欢, 张美凤, 李琦. 余甘子药理作用的研究与开发进展[J]. 当代医药论丛, 2020, 第18卷(12):11-13.

项目来源：山东协和学院实验室开放项目：不同产地余甘子总黄酮含量数据测定及结果分析（项目编号2023SYKF93 ）