蛋白芯片法检测猪肉中喹诺酮类抗生素残留

蛋白芯片法检测猪肉中喹诺酮类抗生素残留

陈文韬1 陈建平2

（1吴川市大山江街道农业技术服务中心，广东吴川，524500

2吴川市农业农村技术推广中心，广东吴川，524500）

智能手机作为一个特殊的检测器，有着其他科学研究仪器所不具备的特点与优势。智能手机的成像技术水平也在不断提高，它可以轻松的完成数据的收集、处理以及传输等。基于此，本文决定运用智能手机的成像技术来检测猪肉中喹诺酮类抗生素的残留量。本次实验主要研究内容如下：

1.诺氟沙星人工抗原的合成与检测

2.利用蛋白芯片法进行检测

3.利用智能手机成像技术提取信号值

4.条件优化

5.肉样的检测

关键词：智能手机成像技术、蛋白芯片法、诺氟沙星、喹诺酮、合成、检测

1.前言

1.1喹诺酮类药物简介

喹诺酮是一类人工合成的抗菌药，它在临床上常被用于治疗肠道感染、呼吸道感染等疾病，并且取得了较为良好的效果。它具有抗菌谱广，抗菌活性强等显著优势，喹诺酮类药物除了能够起到抗菌作用外，它还具有抗疟疾、抗结核作用。喹诺酮类药物除了能够被应用在人体身上外，还能够应用于鸡、鸭、鱼等畜牧养殖业中。在对各类鱼病进行防治的过程中，我们所使用的抗菌鱼药品种类复杂，这些抗菌鱼药大多对人体以及鱼具有较大的副作用，有的可能会导致畸形，有的可能会有致癌作用。近些年的实践结果表明，喹诺酮类药物应用于水产养殖的数量在不断上升，因此，喹诺酮类抗菌药物对水产养殖也有着重要意义。以下是比较常用的几种喹诺酮类抗菌药：

1.2喹诺酮类药物残留研究方法

近些年来，研究人员在对喹诺酮类药物的残留进行研究时多采用微生物检测法、高效液相色谱法、高效液相-串联质谱法(HPLC-MS-MS)、免疫分析法等。

1.2.1微生物检测法

该方法可分为以下两类：平皿法及试管法。平皿法是通过测量待检测样品中残留的抗菌药扩散到平皿琼脂中所形成的抑菌圈的大小来检测样品中抗菌药的残留量的，它以其能够同时定性定量的特性广泛的应用于检测乳制品等食品中抗菌药的残留中。最理想的多平皿法能够检测出喹诺酮类、磺胺类等七大常用抗菌药，但其需要多个检测板，因而成本比较高，并且需要研究人员有熟练的操作技术，所花费的检测时间也较长。而试管法则是依据检测菌的氧化作用或者其生长产生的酸能够使培养基中的指示剂变色的原理来检测食品中残留的抗菌药的。与平皿法相比，试管法只需要观察培养基中酸碱指示剂或者是氧化还原指示剂的颜色变化就能检测抗菌药的残留，其技术要求比平皿法低，操作也更为简便，所需时间也更短，但试管法不能分类鉴定抗菌药。

微生物检测法成本较低,操作比较简单,对于大量样品的快速筛选检测有很大的优势,对高浓度的残留检测比较有效,但缺点就是检测限可能会比样品所规定的最大残留限量(MRL)要高，且灵敏度不高，特异性差。它是一种快速筛选方法，由于微生物的种类众多，因此不同的微生物检测的效果也就不同。

1.2.2色谱分析法

色谱法的结果更为精确，但在进行操作时步骤复杂繁琐，检测时间长并且设备普遍昂贵，所需费用高昂。色谱分析法又包括高效液相色谱法、液相质谱联用法、高效毛细管电泳分析法等检测方法。

童文羽等人采用了高效液相色谱-荧光检测测定方法检测水产品中喹诺酮类药物残留，该方法使用乙腈-磷酸三乙胺作为流动相，建立了测定水产品中诺氟沙星等喹诺酮类药物残留量的方法，具有定性、定量更加准确，精密度高，重现性好等优点。方永卫等人采用高效液相色谱法检测动物性产品中多种氟喹诺酮类药物残留量。

沈春华利用高效液相色谱-串联质谱技术同时检测肉类原料中磺胺类和喹诺酮类药物的残留。钱卓真等人采用高效液相色谱-串联质谱法测定了水产品中19种喹诺酮类药物残留量，该方法用酸化乙腈提取水产品中喹诺酮类药物，正己烷脱脂，外标法定量，操作简单，结果可靠。周梅仙等人采用高效毛细管电泳技术检测鸡蛋中多种喹诺酮类抗生素的残留，该方法具有较高的准确度和精密度，所需样品量少，分析时间短，操作也更加便捷。

1.2.3蛋白芯片分析法

李周敏等人在对牛奶中的喹诺酮类药物残留进行检测时采用了可视化蛋白芯片分析法，利用直接竞争法反应原理，将多个喹诺酮类药物的单克隆抗体制备成微孔板生物芯片，并依次与纳米材料标记的喹诺酮类人工抗原、喹诺酮类药物反应，最后用显色液进行显色，使微孔板上呈现出肉眼可见的阵列点，并将显色后的微孔板用可视化芯片分析仪扫描成像，再将图像导入电脑软件中进行处理，最后提取信号值完成检测。免疫分析法特异性强且反应灵敏，并且可以快速检测大量样品的多组分残留，因此该方法又广泛的应用于食品、临床等的监测。

蛋白芯片分析法在食品中的农兽药残留、生物毒素残留、转基因食品检测等方面具有重要的意义，在采用蛋白芯片分析法进行检测时，不需要复杂的样品预处理，并且速度较快。总之，利用蛋白芯片技术对食品中的残留物进行检测为食品质量提供了一定的保证。同时，蛋白芯片法还能够同时检测出多个血清药品中的抗体。王秀荣等人利用可视化蛋白芯片法同时检测多种禽病血清抗体，其检测速度快，操作简便易行且成本较低。

1.3智能手机成像技术

智能手机如今已经成为了人们生活中必不可少的一件物品，它极大的改变了人与人之间的交流方式以及人们获取信息的方式。通过它，人们可以更加快速的与他人联系，并且更加迅速的从不同的渠道获取信息，同时，它也在科学研究中产生了极大的作用。使用智能手机来进行研究，人们就不必完全依赖于实验室中那些难以携带的实验仪器，并且它的价格也更加的低廉，研究人员可以脱离实验室中那些昂贵的实验仪器的限制。如此以来，在进行科学研究时也就节省了成本。智能手机成像技术在研究中的用途很多，其中一个就是检测违规添加剂。如今我们的智能手机就能够对奶粉中的三聚氰胺进行检测，我们可以利用智能手机获取不同三聚氰胺浓度荧光标准图像，然后利用96孔板制作荧光标准阵列。

2.实验部分

2.1 实验试剂及实验仪器

实验试剂：诺氟沙星、碳二亚胺、牛血清白蛋白、N-羟基琥珀酰亚胺、NN-二甲基甲酰胺、喹诺酮类人工抗原、喹诺酮类人工抗体、吐温20、显色液A、显色液B乙腈、猪肉样品、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠。

实验仪器：氮吹仪、高速离心机、旋涡混合器、微孔板恒温振荡器、数显恒温水浴锅、电子天平、微量移液枪、超纯水仪器。

2.2 PBS缓冲液的配置

称取Nacl8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO4·12H2O2.9g、KCL0.2g及适量蒸馏水于烧杯中，溶解后定容至1000ml备用。

2.3 诺氟沙星人工抗原的合成

诺氟沙星为第三代喹诺酮类抗菌药，其抗菌谱广，抗菌作用强，但其口服吸收效果较差，因此在临床上的应用范围较窄，适用于治疗呼吸道感染、尿路感染等疾病。本次实验在于海峰、谭建华等人的实验基础上进行了改进，同样使用碳二亚胺法，将实验分为了两组，第一组未添加HCL助溶，第二组添加了HCL助溶。

第一组：

分别称取4.0mgNHS、8.0mgEDC、6.3mg的诺氟沙星标准品、400μLDMF。取少许DMF分别与NHS、EDC、NFLX混合，再将三种溶液混合。其中NHS、EDC溶于DMF，NFLX微溶于DMF。在室温下，将混合后的样品放入摇床振荡反应6h后加入3ml的10mg\ml的BSA ，溶液逐渐变浑浊。在室温下将样品放入摇床振荡反应24h。将静置反应24h后的NFLX-BSA离心。取50ml的10×PBS，加入450ml纯水，配制成500ml透析液，取上层清液开始透析，每隔3h换一次透析液，总计换十次。

第二组：

分别称取5.4mgNHS、8.0mgEDC、诺氟沙星标准品6.5mg、400μLDMF以及20μLHCL。取少许DMF分别与NHS、EDC、NFLX混合，再将三种溶液混合，其中NHS、EDC溶于DMF，NFLX微溶于DMF，充分混合后，加入20μL的HCL助溶，加入HCL后，NFLX逐渐溶解，溶液开始变清。在室温下，将混合后的样品放入摇床振荡反应6h后加入3ml的10mg\ml的BSA，溶液逐渐变浑浊。在室温下将样品放入摇床振荡反应24h。将静置反应24h后的NFLX-BSA离心，并取上层清液开始透析，每隔3h换一次透析液，总计换十次。

2.4 免疫芯片分析方法步骤

加250μLBSA于小试管中，再加入1μL抗体，混合均匀，用移液枪分别移取50μL液体于四个微孔板中，再将加好的微孔板放入提前设置好的37℃的恒温水浴锅中加热15min后取出。取出后用纯水清洗两次，并拍干净微孔板上残留的水珠。拍净水珠后，分别加入50μL显色液A于四个微孔板中，再加入50μL显色液B于四个微孔板中，将按次序加好的微孔板放入37℃的恒温水浴锅中水浴加热5min后取出，取出后再用纯水清洗两次后进行观察。

2.5信号值的提取：

首先，用智能手机拍摄显色后并放入暗合的微孔板，再将图片导入PS软件，在软件中设置灰度，并且选择16位通道。其次，翻转图片使图片中的质控点位于图片的上方，然后再对图片进行反相，直至质控点位于图片左上方，保存图片，并将格式设置为Tiff。再次，打开Genepix软件，打开预先保存好的图片，选择green并确定，调整测量信号值的圆圈的直径和位置。最后，开始分析数据并进行数据处理。2.6猪肉样品的前处理在市场随机购买搅碎后的猪肉若干，具体实验步骤如下：

分别取5份1.00mg的肉样于5ml离心管中并将其进行编号；在一号管中加入0μl的100ppb抗原QNS，在二号管中加入2μl的100ppb抗原QNS，在三号管中加入10μl的100ppb抗原QNS，在四号管中加入20μl的100ppb抗原QNS在五号管中加入40μl的100ppb抗原QNS。再向五个管中分别加入2ml乙腈，在旋涡混合器混合5min后，放入离心机离心5min，取上清液；每份取1ml上清液于离心管中，于85℃氮吹仪中进行氮吹；吹干后，加入500μlPBST复溶。

3.结果与讨论

3.1条件优化

为了确定最佳的反应时间以及抗体稀释倍数，进行了以下一系列条件优化。

3.1.1时间优化

在进行时间优化时，分别将反应时间定为15min、30min、45min、60min，具体操作如下：

取250μLBSA于小试管中，再加入1μL抗体，混合均匀，用移液枪分别移取50μL液体于四个微孔板中，再将加好的微孔板放入提前设置好的37℃的水浴锅中加热15min(30min、45min、60min)后取出。取出后用纯水清洗两次，并拍干净微孔板上残留的水珠。拍净水珠后，分别加入50μL显色液A于四个微孔板中，再加入50μL显色液B于四个微孔板中，将按次序加好的微孔板放入水浴锅中水浴加热5min后取出，取出后用纯水清洗两次后再进行观察。

3.1.2抗体稀释倍数优化

用PBS稀释抗体，分别稀释50倍、100倍、200倍、400倍，具体方法如下：

取出4个小试管中，将其编号，在一号小试管中加入49μLPBS，二号小试管中加入99μLPBS，三号小试管中加入199μLPBS，四号小试管中加入399μLPBS，再向四个小试管中分别加入1μL抗体，并混合均匀。通过对不同稀释倍数的比较分析，本次实验将抗体稀释倍数确定为100倍。

3.2标准曲线的绘制：

本次实验在探索喹诺酮类药物的标准曲线时采用的是间接竞争法。微孔板上除质控点外，还有两个微阵列点，并且位于质控点下方，所采用的信号值为两点的平均值。实验证明，在一定范围内，随着竞争对照品浓度的上升，抗体所能够结合的人工抗原的含量会随之降低，并且检测到的灰度值会越来越低。

取经过处理后的50μl复溶溶液于微孔板中，加入50μl稀释了50倍的QNS抗体；放入37℃水浴锅反应45min。充分反应后取出，用去离子水进行清洗，并拍干孔板中残留的水分。依次滴加50μl的显色液A与显色液B；最后放入水浴锅37℃加热显色7min。将显色后的孔条置于自制的暗合中后用智能手机进行拍摄，将拍摄获取的照片通过Photoshop进行反相处理后再将图片通过信号提取软件（genepix）提取对应孔点的信号值。

本次结果为三次实验所得结果的平均值。最终得到的加标回收率均在80%-120%之间。回收率的计算公式如下：

回收率=(测得值-本底值)/加标值*100%

3.4诺氟沙星检测限

检测20个阴性猪肉样品中喹诺酮的含量，根据标准曲线计算该方法的检测限。检测限的计算方法为20个阴性猪肉样本的检测结果平均值，加上3倍标准偏差。计算结果为0.2ng/mL。

4.总结与展望

本次实验基于智能手机成像技术，利用可视化蛋白芯片法对在市场中随机称取的猪肉样品中喹诺酮类抗生素残留含量进行了检测。在人工抗原的合成过程中，本次实验在于海峰等人的基础上对其实验步骤进行改进，并且在NHS、EDC、NFLX和DMF混合后加入了HCL进行助溶。在提取信号值的过程中，我采用了不同型号的手机进行比较。经过比较，我决定选择三星手机作为提取信号值的工具。用三星手机分别拍摄不同的显色后的微孔板，然后再将拍摄好的内容上传至电脑中，再利用PS软件对拍摄的微孔板进行处理，最后将处理好的图片导入软件中，提取其中的信号值。通过条件优化，我将反应时长确定为45min，抗体稀释倍数确定为100倍。猪肉样品的加标回收率均在80％～120％。

参考文献：

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