二甲双胍通过治疗大鼠II型糖尿病肾病的作用机制

二甲双胍通过治疗大鼠II型糖尿病肾病的作用机制

王楠1 彦名南1 范甜甜1林栋2隋宏书3 王俞杰1*

（1.山东第一医科大学临床与基础医学院，济南 2.山东第一医科大学临床与基础医学院免疫学系，济南；3.山东第一医科大学临床与基础医学院组织学与胚胎学系，济南）

【摘要】 目的：探究二甲双胍通过治疗大鼠II型糖尿病肾病的作用机制。方法：将40只雄性SD大鼠随机分成三组：空白对照组（A组）、2型糖尿病模型组（B组）、II型糖尿病-二甲双胍干预组（C组）。A组8只，B组24只，C组8只。B组再随机均分成B1,B2,B3三组，每组八只。通过饲喂高脂高糖饲料并结合腹腔注射链脲霉素（STZ）建立II型糖尿病大鼠模型。建模成功后，进行二甲双胍干预实验，而后通过采集二甲双胍干预实验中相关大鼠的粪便进行粪菌移植实验。进行基本状态评估，血糖评估，肾脏形态学观察，炎症因子检测，肠道菌群检测，肠道屏障状态评估。结论：二甲双胍对II型糖尿病肾病有一定的保护和治疗作用。 

关键词：二甲双胍；II型糖尿病；大鼠

中图分类号: Q813.7            文献标识码：A

第一作者：王楠，2020级临床医学本科专业在读本科生

通讯作者: 王俞杰   ，E-mail:2579728429@qq.com

基金资助：山东第一医科大学校级大学生创新创业训练计划项目（No.2022104391091）

1. 前言

II型糖尿病发生时常易引发II型糖尿病肾病(T2DN）这样的血管并发症。II型糖尿病患者的肾脏结构在病情初期出现肾小管肥大，并伴有肾小球肥大及基底膜增厚，随着病情的发展，患者最终会出现肾小管萎缩和间质纤维化等一系列病症[1]。因此研究二甲双胍的作用机制显得十分重要。II型糖尿病肾病是II型糖尿病患者致残、致死的重要原因，尚无十分有效的治疗手段。二甲双胍作为治疗II型糖尿病的一线用药，对II型糖尿病肾病展现出一定的保护和治疗作用。II型糖尿病患者肠道菌群失调造成的肠道屏障损伤诱发的炎症因子水平上升可能导致肾脏组织损伤。基于我们的前期研究，二甲双胍具有良好的平衡肠道菌群并修复肠道屏障的功能。但是，二甲双胍是否通过影响肠道菌群来治疗II型糖尿病肾病目前还未见报道。本项目拟通过对传统II型糖尿病药物二甲双胍干预肠道菌群治疗此疾病的研究，为II型糖尿病肾病的治疗提供新思路。

2.材料与方法

2.1试验动物  购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，大鼠品系SD，清洁级；6-8周龄

2.2实验动物分组及处理过程

40只雄性SD大鼠随机分成三组：空白对照组（A组）、2型糖尿病模型组（B组）、II型糖尿病-二甲双胍干预组（C组）。A组8只，B组24只，C组8只。B组再随机均分成B1,B2,B3三组，每组八只。A组于正常条件下喂养8周，B、C组为使体重约达300-320g使用高糖、高脂饲料喂养8周至体重。经过8周的高糖高脂喂养后，B、C组联合1%的浓度的柠檬酸钠缓冲液溶解链脲佐菌素（STZ）腹腔注射40mg/Kg/只（柠檬酸缓冲溶液配置），A组腹腔注射等量缓冲液，建立大鼠糖尿病模型。C组灌肠给药二甲双胍，而后通过采集二甲双胍干预实验中相关大鼠的粪便进行粪菌移植实验。在无菌的离心管内收集约100mg新鲜供体大鼠的粪便，加入生理盐水后离心收集上清液。将上清液经无菌灌胃针灌入受体细胞胃中，连续移植8周。

2.3检测指标

2.3.1肾脏组织切片观察大鼠肾脏组织病理变化

给药周期结束后，制作肾脏组织切片并观察。

1）制作石蜡切片

2）HE染色

3）肾小管损伤评分

对肾小管坏死分级采用的方法是Paller肾小管损伤评分，肾小管损伤程度越严重，分数就越高。具体评分方法见下表：

表1Pller 肾小管损伤评分标准

2.3.2肾组织MDA含量的测定

制备组织匀浆液之后，按丙二醛（MDA）含量测定试剂盒步骤进行。

2.3.3血清尿素氮（BUN）的检测

按试剂盒说明进行检测，得到尿素氮的含量。

2.3.4统计方法

统计分析采用 SPSS26.0 ，使用PrismGraph 9.0软件制图，计量资料的表示方法均采用平均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，如果是组间两两比较，采用最小显著性差异法(LSD-t)检验，方差不齐者采用 Dennett’s 检验，以 P<0.01 表示两组差异有统计学意义

3.1 大鼠肾脏组织病理变化

图1. 大鼠肾脏组织病理变化（H&E染色，A.对照组；B. 模型组；C. 二甲双胍组）

对照组HE染色见大鼠肾组织结构正常，没有发现异常病理改变；模型组可见肾小管萎缩和间质的纤维化，肾小球基底膜增厚和系膜基质增多；与模型组相比，肾脏损伤程度明显减轻，但与对照组相比仍存在一定程度的病理异常，部分肾小管坏死程度降低。

3.2 大鼠肾小管损伤Paller评分

图2. 各组大鼠肾小管损伤Paller评分的检测

三组Paller评分差异显著；模型组明显高于对照组，二甲双胍组明显低于模型组，但仍显著高于对照组。

3.3 大鼠肾组织MDA

图3. 各组大鼠肾组织MDA活力水平的检测

模型组MDA含量明显大于对照组；二甲双胍组明显低于模型组，但仍显著高于对照组。

3.4 大鼠血清BUN

图4. 各组大鼠血清BUN水平的检测

三组大鼠血清BUN含量差异显著；二甲双胍组显著大于对照组，明显小于模型组。

4.讨论

在本实验中，相比模型组，二甲双胍组肾脏损伤程度有所减轻，同时肾组织MDA含量、血清BUN含量显著下降。根据陈淼[2]等人报道，二甲双胍具有降低白蛋白排泄率和尿蛋白氮的功能，展现出较好的肾脏保护功能。但并没有进一步展开更为详细的研究，也没有阐述其作用机制。梅艳[3]等人的研究发现,T2DN往往伴随各种炎症因子表达水平的增高，二甲双胍可能通过抑制肾脏炎症因子的表达，从而对肾脏起到保护作用，但是并没有深入探讨炎症因子表达水平升高的具体原因以及二甲双胍更为深层次的作用靶点和作用机制。二甲双胍作为临床治疗T2DM的一线用药,同时也改变了T2DM患者肠道菌群组成与丰度，使产生内毒素的致病菌丰度下降，降低T2DM患者的炎症因子水平[4]。同时研究结果显示，将正常小鼠的肠道菌群移植到糖尿病小鼠体内，可以使微生物多样性和产丁酸细菌数量增加[5]并且明显改变其肠道菌群结构，从而展现出降低血糖作用[6-7],是当前国内外针对肠道菌群的研究实验中热门的研究方法。本课题需改进：还可检测肾组织Scr水平近一步判断肾功能的损伤程度；需明确二甲双胍改善II型糖尿病肾病的分子机制。实验并未深入到基因水平或是某一基因通路，本课题组将继续深入研究二甲双胍对糖尿病肾病作用的分子机制，为临床精准用药提供参考意见。

参考文献

[1]Hoshino J, Mise K, Ueno T, et al.A pathological scoring system to predict renal outcome in diabetic nephropathy. Am J Nephrol. 2015;41(4-5):337-44.

[2]陈淼,娄宁,陈福莲,等.二甲双胍对2型糖尿病肾病患者肾功能的影响[J].南京医科大学学报(自然科学版),2010,30(05):713-716.

[3]梅艳,欧三桃.二甲双胍对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其机制研究[J].中国现代医学杂志,2017,27(20):1-5.

[4]Zhang X, Zhao Y, Xu J, et al. Modulation of gut microbiota by berberine and metformin during the treatment of high-fat diet-induced obesity in rats. Sci Rep. 2015 Sep 23;5:14405.

[5]Vrieze A, Van Nood E, Holleman F, et al. Transfer of intestinal microbiota from lean donors increases insulin sensitivity in inpiduals with metabolic syndrome [ J ].Gastroenterology ,2012,143(4):913-916.

[6]Hou D, Pan Q, Shen F, et al. Total fecal microbiota transplantation alleviates high-fat diet-induced steatohepatitis in mice via beneficial regulation of gut microbiota [J]. Sci Rep.2017,7(1).1529

[7]沈培亮. 番泻苷A通过调节肠道菌群改善糖尿病的机制研究[D].南京中医药大学,2017.