中药提取物混合粉长期毒性及致畸实验研究

中药提取物混合粉长期毒性及致畸实验研究

杨洋  刘波

贵州农业职业学院 贵州贵阳 551400

【摘要】目的研究中药提取物混合粉长期毒性情况，了解中药提取物长期服用的安全性。方法 采用限量法的雌、雄性大鼠急性经口毒性试验，遗传毒性试验（细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验），90天经口毒性试验，致畸试验。结果 在本试验条件下，知母乌梅中药提取物混合粉雌、雄性大鼠急性经口毒性试验的LD50均大于20.0g/kg.bw，根据急性毒性剂量分级标准，属实际无毒级；细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性；知母乌梅中药提取物混合粉以2.5g/kg.bw、5.0g/kg.bw、7.5g/kg.bw的剂量经口给予大鼠90天，受试动物一般情况良好，试验结束时雌雄大鼠体重、总增重、总摄食量及总食物利用率与对照组比较均无显著性差异（P＞0.05）；脏器重量、脏器系数均无异常改变；眼部检查未发现异常变化；尿液指标、血液学指标及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围；各脏器病理组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变（P＞0.05）。知母乌梅中药提取物混合粉对大鼠未见母体毒性、胚胎毒性和致畸性。结论知母乌梅中药提取物混合粉长期服用具有安全性。

关键词：知母；乌梅；长期毒性

中药知母为百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bunge）的干燥根茎，味苦，性寒，归肺、胃、肾经，具有清热泻火、滋阴润燥等功效。主治温热病，高热烦渴，消渴等症，是常用的苦寒清热药，具有悠久的降血糖应用历史[1]。数十年来，国内外学者已对知母的化学成分进行了广泛深入的研究，发现知母中富含甾体皂苷类、黄酮类、木脂素类、多糖类、微量元素等[2]。

乌梅作为一种传统中药，味酸、微涩，具敛肺生津、涩肠安蛔之功，由于能刺激唾液分泌，生津止渴，常用来治疗口渴多饮的消渴(如糖尿病)，在《伤寒论》326条中就记载着乌梅制剂对于“消渴”的治疗，并改善患者易饥、口渴、疲乏无力等症状［3］。

本试验通过观察知母提取物、乌梅提取物混合粉连续灌胃对大鼠的长期毒性，评价知母乌梅中药提取物混合粉长期服用的安全性。

1试验材料

1.1试验药物

1.1.1知母提取物，知母经60%乙醇回流提取3次，每次1.5h，过滤、合并滤液、浓缩、喷雾干燥得知母提取物，芒果苷5%，提取得率约11%。

1.1.2乌梅提取物，乌梅经8倍量60%乙醇回流提取3次，每次2h，过滤、合并滤液、浓缩、喷雾干燥得乌梅提取物，提取率约10%，含枸橼酸约20%。

以上工艺制备所得的知母提取物、乌梅提取物按照2:1混合均匀，制得知母乌梅中药提取物混合粉，人体推荐剂量1.5g/人/d，折算到知母提取物为1.0g/人/d，乌梅提取物为0.5g/人/d。

1.2实验动物SPF级昆明种小鼠，体重25～35g，SPF级健康离乳SD大鼠，体重180～220g，雌雄各半。

1.3 试验方法

1.3.1急性经口毒性试验：采用限量法，选用SPF级健康离乳SD大鼠20只，雌雄各半。急性经口毒性剂量为20.0g/kg.bw。给样后连续观察14天，记录中毒表现及死亡情况。期间每周称量一次体重。

1.3.2 细菌回复突变试验：采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535五株菌株进行试验。首次试验采用平板掺入法，证实试验采用预培养平板掺入法。采用β-萘黄酮和苯巴比妥钠诱导的大鼠肝S9作为体外代谢活化系统。首次试验剂量设为5000μg/皿、1500μg/皿、500μg/皿、150μg/皿和50μg/皿，同时设自发回变、溶剂对照和阳性突变对照，通过首次试验确定受试物的溶解度与细菌毒性。根据首次试验结果设定证实试验的剂量设为5000μg/皿、1500μg/皿、500μg/皿、150μg/皿和50μg/皿。样品置于0.103Mpa条件下高温灭菌20min，在无菌条件下，称量受试样品并配制成溶液，受试样品用无菌水配制成50mg/mL，即高剂量组，用无菌水按一定倍比逐级稀释配制成15、5、1.5、0.5mg/mL4个剂量组。

1.3.3 哺乳动物红细胞微核试验：选用SPF级昆明种小鼠50只，动物购买后适应环境3天进行试验。按体重随机分为5个组，每组10只，雌雄各半。小鼠灌胃体积按20mL/kg.bw计算，受试样品最高剂量设10.0g/kg.bw，中、低剂量设5.0g/kg.bw、2.5g/kg.bw，同时设溶剂(蒸馏水)对照组，40mg/kg·bw环磷酰胺为阳性对照组，采用30h给受试物法两次给受试样品间隔24h，第二次给受试样品后6小时处死动物，取胸骨常规制片、镜检。每鼠计数2000个骨髓嗜多染红细胞（PCE），观察含微核的嗜多染红细胞数并计算微核发生率，以千分率计。每鼠计数

200个嗜多染红细胞时所观察到的成熟红细胞数（NCE），并计算嗜多染红细胞与总红细胞比值（PCE/RBC）。

1.3.4 体外哺乳类细胞染色体畸变试验：选用中国仓鼠肺（CHL）细胞株。据细胞毒性和受试样品溶解情况，选择5000、2500、1250µg/mL3个剂量组进行染色体畸变试验。在无代谢活化条件下，采用直接致突变物丝裂霉素做为阳性对照物，浓度为0.25μg/mL；在有代谢活化条件下，采用间接致突变物环磷酰胺做为阳性对照物，浓度为15μg/mL。试验前一天，将一定数量的细胞接种于培养皿中，放CO2培养箱内培养。试验时，吸去培养皿中的培养液，加入一定浓度的受试物、S9mix（不加S9mix时，需用培养液补足）以及一定量不含血清的培养液，放培养箱中处理3h。处理结束后，吸去含受试物的培养液，用PBS溶液洗细胞3次，加入含10%胎牛血清的培养液，放回培养箱,于24h收获细胞。于收获前4h，加入细胞分裂中期阻断剂秋水仙素，作用时间为4h，终浓度为1μg/mL。收获的细胞经消化、低渗、固定后滴片、染色以备阅片。在油镜下阅片，每一个剂量组应分析不少于100个分散良好的中期分裂相。

1.3.5 90天经口毒性试验：

1.3.5.1剂量选择及分组：试验设3个剂量组和一个对照组，剂量组按照人体推荐服用量的100、200、300倍设计，分别为2.5g/kg.bw、5.0g/kg.bw、7.5g/kg.bw，用蒸馏水配置成一定浓度的受试物液，对照组给予等体积的蒸馏水，每日灌胃一次(1.0ml/100 g·bw) 。

1.3.5.2 方法及时间：采用经口染毒，每日灌胃一次，连续90d。每天观察并记录动物的一般表现、行为、中毒表现和死亡情况。每周称1次体重和2次食物摄入量。计算动物增重、摄食量、食物利用率等，在试验前和试验结束时，至少对高剂量组和对照组大鼠进行眼部检查。若发现高剂量组动物有眼部变化，则应对所有动物进行检查。测定血常规、生化等血液学指标。大鼠在试验结束时进行尿液常规检查，实验结束将动物处死并进行大体解剖，肉眼观察有无异常，称量并计算脏体比值，进行主要组织病理学检查。

1.3.5.3 数据处理：采用SPSS11.0统计软件对数据分别进行One-way ANOVA分析及Dunnett检验，检验水准α=0.05。

1.3.6致畸试验：对受孕SD大鼠于受孕第6天-第15天每天灌胃分别给予2.5g/kg.bw、5.0g/kg.bw、7.5g/kg.bw剂量的知母乌梅中药提取物混合粉，阳性对照组给予0.28g/kg.bw的阿司匹林，于孕第20天处死孕鼠，解剖观察孕鼠胚胎毒性指标及胎鼠生长发育指标。

2结果

2.1 大鼠急性经口毒性试验：在14d观察期内，雌、雄大鼠外观均正常，四肢活动正常，无死亡。剖检未出现肉眼可见病变。获得知母乌梅中药提取物混合粉雌雄大鼠急性经口毒性试验LD50＞20.0g/kg.bw。根据急性毒性分级标准，将其判定为无毒级物质。

2.2遗传毒性试验：细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性。

2.3 90天经口毒性试验：

2.3.1一般情况观察各组动物生长发育、活动均正常，大鼠毛发光润，摄食、饮水、粪便均正常。无中毒表现和死亡。

2.3.2对大鼠体重、增重及食物利用率的影响与阴性对照组相比，各剂量组动物每周体重、体重增加量、进食量和食物利用率均无统计学差异（P>0.05）。90天喂养结束时，与阴性对照组相比各剂量组动物总体重增加量、总进食量和总食物利用率均无统计学差异（P>0.05）。

2.3.3眼部检查：在试验前和试验结束时，对高剂量组和对照组大鼠进行眼部检查。未发现高剂量组和对照组动物有眼部异常变化。

2.3.4大鼠尿常规指标：经口给予大鼠不同剂量的知母乌梅中药提取物混合粉90天，测定大鼠尿常规指标。结果各剂量组尿常规指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05）。

2.3.5大鼠血液学指标：经口给予大鼠不同剂量的知母乌梅中药提取物混合粉90天，测定各剂量组大鼠血液红细胞计数、血红蛋白水平、白细胞计数及其分类等指标、红细胞压积、血小板计数等指标。结果各剂量组的各指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05），结果见表1。

表1知母乌梅中药提取物混合粉对大鼠血液学指标的影响(±s)（n=10）

2.3.6大鼠血液生化指标：经口给予大鼠不同剂量的知母乌梅中药提取物混合粉90天，测定各剂量组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、谷氨酰转肽酶、尿素、肌酐、血糖、总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、氯、钾、钠的水平。结果各剂量组的各指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05）。

2.3.7大体病理及组织学检查：经口给予大鼠不同剂量的知母乌梅中药提取物混合粉90天，测定各组大鼠心脏、胸腺、肾上腺、肝脏、肾脏、脾脏、睾丸、卵巢绝对重量及相对重量（脏/体）。结果各剂量组的各指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05）。各剂量组雌雄大鼠大体解剖观察均未见异常改变。大体解剖观察未发现与受试样品有关的组织病理学改变。

2.4 致畸试验：阳性对照组实验末期体重和总增重、平均活胎数、子宫连胎重、胎仔体重均显著低于阴性对照组（P<0.05）,死胎及吸收胎的发生率显著高于阴性对照组（P<0.05）；胎鼠体长显著减少（P<0.05）；前囟宽、头骨、胸骨、肋骨、四肢骨、脊骨、骨盆骨发育不全的异常率显著高于阴性对照组（P<0.05）；阳性对照组部分胎鼠出现明显的外观、内脏、骨骼畸形。各剂量组孕鼠体重、增重、子宫连胎重、黄体数、着床数、活胎数、死胎及吸收胎发生率、胎鼠体重、体长、胎鼠外观、骨骼及内脏发育情况与阴性对照组比较，无显著性差异（P>0.05）。

3结论：本次实验首次较为系统地采用急性毒性、遗传毒性和长期食用毒性进行了初步的用药安全性考察。实验结果表明知母乌梅中药提取物混合粉对实验小鼠、大鼠无明显的毒副作用，初步证明了知母提取物、乌梅提取物的安全性良好，可进一步用于临床开发研究。

参考文献

[1]国家药典委员会. 中华人民共和国药典（一部）[M]. 北京：中国医药科技出版社，2015.

[2]刘卓，隋海娟，闫恩志，等. 知母皂苷对脂多糖引起巨噬细胞分泌TNF-α和 NO的影响及机制[J].中药药理与临床，2013，29（1）：65-67.

[3]李洁，李忠，陈信义．乌梅丸临床实践与体会［J］．中医药信息，2012，29(2) : 64－65．